Arrêté du 14 Moharram 1439 correspondant au 5 octobre 2017 rendant obligatoire la méthode horizontale pour le dénombrement des coliformes par comptage des colonies

En application des dispositions de l'article 19 du décret exécutif n° 90-39 du 30 janvier 1990, modifié et complété, susvisé, le présent arrêté a pour objet de rendre obligatoire la méthode horizontale pour le dénombrement des coliformes par comptage des colonies.

Pour le dénombrement des coliformes par comptage des colonies, les laboratoires du contrôle de la qualité et de la répression des fraudes et les laboratoires agréés à cet effet, doivent employer la méthode jointe en annexe du présent arrêté.

Cette méthode doit être utilisée par le laboratoire, lorsqu'une expertise est ordonnée.

Le présent arrêté sera publié au Journal officiel de la République algérienne démocratique et populaire.

Fait à Alger, le 14 Moharram 1439 correspondant au 5 octobre 2017.

Mohamed BENMERADI. 13 décembre 2017 ANNEXE METHODE HORIZONTALE POUR LE DENOMBREMENT DES COLIFORMES PAR COMPTAGE DES COLONIES

1. DOMAINE D'APPLICATION :

La présente méthode spécifie des directives générales pour le dénombrement des coliformes.

Elle s'applique à des produits destinés à la consommation humaine et aux produits destinés à l'alimentation animale, et à des échantillons environnementaux au voisinage de la production et de la manipulation des denrées alimentaires et ce, par comptage des colonies après incubation à 30 °C ou à 37 °C en milieu solide.

NOTE :

Dans le cas du lait et des produits laitiers, la température d'incubation est de 30 °C.

Cette méthode est recommandée lorsque le nombre attendu est supposé être supérieur à 100 coliformes par millilitre ou par gramme d'échantillon analysé.

2. DEFINITION :

Coliformes :

Bactéries qui, à la température spécifiée, forment des colonies caractéristiques en gélose lactosée biliée au cristal violet et au rouge neutre et fermentent le lactose avec production de gaz lors de l'essai de confirmation, et ce, lorsque l'essai est effectué dans les conditions spécifiées dans la présente méthode.

3. PRINCIPE : 3.1 Préparation de deux boîtes de Petri en utilisant un milieu de culture sélectif solide et une quantité spécifiée de l'échantillon pour essai, si le produit initial est liquide ou une quantité spécifiée de la suspension mère dans le cas d'autres produits.

Préparation d'autres boîtes de Petri dans les mêmes conditions, en utilisant des dilutions décimales de l'échantillon pour essai ou de la suspension mère. 3.2 Incubation des boîtes à 30 °C ou à 37 °C pendant 24 h. 3.3 Comptage des colonies caractéristiques et, si nécessaire, confirmation du nombre de colonies par fermentation du lactose. 3.4 Calcul du nombre de coliformes par millilitre ou par gramme d'échantillon à partir du nombre de colonies caractéristiques dénombrées par boîte de Petri.

4. MILIEUX DE CULTURE ET DILUANTS : 4.1 Généralités :

Au cours de l'analyse, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l'eau distillée ou déionisée stérilisée. 24 Rabie El Aouel 1439 JOURNAL OFFICIEL DE 13 décembre 2017 4.2 Diluants :

Il convient de préparer les diluants conformément aux recommandations spécifiées dans les méthodes relatives à la préparation des échantillons pour essai, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique, fixées par la réglementation en vigueur. 4.3 Milieu de culture 4.3.1 Milieu sélectif solide : gélose lactosée biliée au cristal violet et au rouge neutre (VRBL) : 4.3.1.1 Composition :

Digestat enzymatique de tissus animaux 7g Extrait de levure 3g Lactose (C12 H22 O11,H2 O) 10g Chlorure de sodium 5g Sels biliaires 1,5g Rouge neutre 0,03g Cristal violet 0,002g Agar-agar 12g à 18 ga Eau 1000 ml a selon le pouvoir gélifiant de l'agar-agar. 4.3.1.2 Préparation :

Pour conserver le pouvoir sélectif et la spécificité du milieu, il convient de procéder comme suit :

Mélanger soigneusement les composants ou le milieu complet déshydraté dans l'eau et laisser reposer plusieurs minutes. Ajuster le pH de sorte qu'après ébullition, il soit de 7,4 ± 0,2 à 25 °C. Chauffer jusqu'à ébullition en agitant de temps en temps.

Laisser bouillir deux minutes. Mettre le milieu à refroidir immédiatement au bain d'eau (5.5) à une température de 44 °C à 47 °C.

Eviter le surchauffage du milieu (un chauffage trop prolongé ou des chauffages répétés).

Ne pas stériliser à l'autoclave.

Contrôler la stérilité du milieu au moment de l'emploi (8.2.2).

Utiliser le milieu dans les quatre (4) heures qui suivent sa préparation.

LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 72 19 4.3.2 Milieu de confirmation : bouillon lactosé bilié au vert brillant : 4.3.2.1 Composition :

Digestat enzymatique de caséine 10g Lactose (C12H22O11,H20) 10g Bile de bœuf déshydratée 20g Vert brillant 0,0133g Eau 1000 ml 4.3.2.2 Préparation :

Dissoudre les composants du milieu complet déshydraté dans l'eau en chauffant doucement, si nécessaire, dans un bain d'eau (5.5).

Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation, il soit de 7,2 ± 0,2 à 25 °C.

Répartir les milieux par quantités de 10 ml dans des tubes à essai (5.7) contenant des cloches de Durham (5.8).

Stériliser à l'autoclave (5.1) à 121 °C pendant 15 mn.

Les cloches de Durham ne doivent pas contenir de bulles d'air après stérilisation.

5. APPAREILLAGE ET VERRERIE :

Matériel courant de laboratoire de microbiologie et notamment, ce qui suit : 5.1 Appareil pour la stérilisation en chaleur sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave). 5.2 Etuve réglable à 30 °C ± 1°C ou à 37 °C ± 1°C. 5.3 Boîtes de Petri en verre ou en plastique d'un diamètre de 90 mm à 100 mm. 5.4 Pipettes à écoulement total ayant une capacité nominale de 1 ml. 5.5 Bain d'eau ou dispositif similaire capable de fonctionner de 44 °C à 47 °C ou à 100 °C. 5.6 Appareil de comptage de colonies comportant un système d'éclairage et un compteur numérique mécanique ou électronique. 5.7 Tubes à essai de dimensions approximatives 16 mm x 160 mm. 5.8 Cloches de Durham de dimensions appropriées en vue de leur utilisation dans les tubes à essai (5.7). 5.9 Flacons pour l'ébullition et la conservation des milieux de culture. 5.10 pH-mètre précis à 0,1 unité de pH à 25 °C. 5.11 Anse bouclée en platine iridiée ou en nickel chrome ayant un diamètre de 3 mm environ ou anses à usage unique.

6. ECHANTILLONNAGE :

L'échantillon doit être réellement représentatif, non endommagé ou modifié lors du transport et de l'entreposage.

L'échantillonnage doit être effectué conformément aux exigences fixées par la réglementation en vigueur, le cas échéant, aux normes reconnues.

7. Préparation de l'échantillon pour essai :

La préparation de l'échantillon pour essai doit être effectuée conformément aux méthodes d'analyses spécifiées dans la réglementation en vigueur.

8. MODE OPERATOIRE : 8.1 Prise d'essai, suspension mère et dilutions :

La suspension mère et les dilutions doivent être préparées conformément aux méthodes relatives à la préparation des échantillons pour essai, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique, fixées par la réglementation en vigueur. 8.2 Ensemencement et incubation : 8.2.1 Prendre deux boîtes de Petri stériles pour le produit liquide et/ou pour chaque dilution choisie.

Transférer à l'aide d'une pipette stérile (5.4), 1 ml de liquide ou des dilutions appropriées au centre de chaque boîte. Utiliser une nouvelle pipette stérile pour inoculer chaque dilution dans les boîtes. 8.2.2 Verser environ 15 ml du milieu VRBL (4.3.1), à une température de 44 °C à 47 °C , dans chaque boîte de Petri. Le temps qui s'écoule entre la fin de la préparation de la suspension mère (ou de la dilution 10-1 dans le cas d'un produit liquide) et le moment où le milieu est versé dans les boîtes ne doit pas dépasser 15 mn.

Mélanger soigneusement l'inoculum au milieu de culture et laisser le mélange se solidifier en posant les boîtes de Petri sur une surface froide et horizontale.

Préparer également une boîte témoin avec environ 15 ml du milieu pour contrôler sa stérilité. 8.2.3 Après solidification complète, couler à la surface du milieu ensemencé environ 4 ml du milieu VRBL (4.3.1), à une température de 44 °C à 47 °C. Laisser solidifier comme décrit ci-dessus. 8.2.4 Retourner les boîtes ainsi préparées et les incuber dans l'étuve (5.2) réglée à 30 °C ou à 37 °C pendant 24 h ± 2 h. 8.3 Dénombrement :

Après la période d'incubation spécifiée au point (8.2.4), sélectionner les boîtes de Petri ayant, si possible, un nombre compris entre 10 et 150 colonies. Procéder au comptage à l'aide du compteur (5.6) des colonies violacées ayant un diamètre minimal de 0,5 mm (parfois entourées d'une zone rougeâtre due à la précipitation de la bile). Ces colonies sont considérées comme des colonies typiques de coliformes et ne nécessitent pas de confirmation. 13 décembre 2017 Dénombrer également et confirmer les colonies atypiques (par exemple celles de taille plus petite) et toutes les colonies dérivées des produits laitiers contenant des sucres autres que le lactose immédiatement après la période d'incubation, selon (8.4).

La conversion des sucres autres que le lactose peut entraîner la formation de colonies, ayant une apparence similaire aux colonies typiques de coliformes.

NOTE :

L'aspect de la zone rougeâtre dû à la précipitation de la bile entourant les colonies dépend du type de coliformes et de la qualité du milieu. 8.4 Confirmation :

Si nécessaire, inoculer cinq (5) colonies atypiques dans des tubes de bouillon lactosé bilié au vert brillant (4.3.2).

Mettre les tubes à incuber dans l'étuve (5.2) réglée à 30 °C ou à 37 °C pendant 24 h ± 2 h.

Considérer les colonies présentant une formation de gaz dans les cloches de Durham (5.8) comme des coliformes.

Tenir compte de ces résultats dans le calcul (9).

9. EXPRESSION DES RESULTATS : 9.1 Mode de calcul : cas après identification ou confirmation :

Lorsque la méthode utilisée nécessite une confirmation, un nombre déterminé A (en général 5) de colonies caractéristiques présumées est confirmé à partir de chacune des boîtes retenues pour le comptage des colonies. Après confirmation, calculer, pour chacune des boîtes, le nombre a de colonies répondant aux critères de confirmation à l'aide de la formule suivante : b a = — x C A Où : b : est le nombre de colonies répondant aux critères de confirmation parmi les A colonies identifiées ;

C : est le nombre total de colonies caractéristiques présumées comptées sur la boîte.

Arrondir les résultats calculés au nombre entier le plus proche. Pour cela, si le premier chiffre après la virgule est inférieur à 5, le chiffre précédent n'est pas modifié ; si le premier chiffre après la virgule est supérieur ou égal à 5, le chiffre précédent est augmenté d'une unité.

Calculer le nombre N de micro-organismes identifiés ou confirmés présents dans l'échantillon pour essai à l'aide de l'équation suivante : ∑a N = ————— V x 1,1 x d 24 Rabie El Aouel 1439 JOURNAL OFFICIEL DE 13 décembre 2017 ∑a : est la somme des colonies répondant aux critères de confirmation comptées sur les deux boîtes retenues de deux dilutions successives ;

V : est le volume de l'inoculum appliqué à chaque boîte, en millilitres ; d : est le taux de dilution correspondant à la première dilution retenue.

Arrondir le résultat calculé à deux chiffres significatifs.

Pour cela, si le troisième chiffre est inférieur à 5, ne pas modifier le chiffre précédent ; si le troisième chiffre est supérieur ou égal à 5, augmenter le chiffre précédent d'une unité.

Exprimer le résultat, de préférence en nombre compris entre 1 et 9,9 multiplié par la puissance appropriée de 10, ou un nombre entier avec deux chiffres significatifs.

Exprimer le résultat comme le nombre N de coliformes par millilitre (produits liquides) ou par gramme (autres produits).

EXEMPLE : Un comptage a donné les résultats suivants :

— à la première dilution retenue (10-3) : 66 colonies ;

— à la deuxième dilution retenue (10-4) : 4 colonies.

Des colonies sélectionnées ont été soumises aux essais d'identification ou de confirmation :

— des 66 colonies, 8 colonies ont été soumises à essai, dont 6 ont répondu aux critères de confirmation ; d'où a = 50 ;

— des 4 colonies, les 4 ont toutes répondu aux critères de confirmation ; d'où a = 4. ∑a 50 + 4 54 N = ———— = —————— = ———— = 16545 V x 1,1 x d 1 x 1,1 x 10-3 1 x 1,1 x 10-3 En arrondissant le résultat tel que spécifié ci-dessus, le nombre de coliformes est de 17 000 ou 1,7 x 104 par millilitre ou par gramme de produit. ————★————