قرار مؤرخ في 21 محرّم عام 1434 الموافق 5 ديسمبر سنة 2012، يجعل منهج كشف وإحصاء بسودوموناس أيروجينوزا في الماء بالترشيح فوق الغشاء، إجباريا

تطبيقا لأحكام المادة 19 من المرسوم التنفيذي رقم 90-39 المؤرخ في 3 رجب عام 1410 الموافق 30 يناير سن ة 1990، المعدّل والمتمّم والمذكور أعلاه، يهدف هذا القرار إلى جعل منهج كشف وإحصاء بسودوموناس أيروجينوزا في الماء بالترشيح فوق الغشاء، إجباريا.

من أجل كشف وإحصاء بسودوموناس أيروجينوزا في الماء بالترشيح فوق الغشاء، فإن مخابر مراقبة الجودة وقمع الغش وتلك المعتمدة لهذا الغرض، ملزمة باستعمال المنهج المبين في الملحق المرفق بهذا القرار.

يجب أن يستعمل هذا المنهج من طرف المخبر عند الأمر بإجراء خبرة.

ينشر هذا القرار في الجريدة الرسمية للجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية.

حرر بالجزائر في 21 محرّم عام 1434 الموافق 5 ديسمبر سنة .2012 مصطفى بن بادة الملحق منهج كشف وإحصاء بسودوموناس أيروجينوزا في الماء بالترشيح فوق الغشاء يصف هذا المنهج تقنية عزل وإحصاء بسودوموناس أيروجينوزا في عينات الماء المعبأ، بالترشيح فوق الغشاء.

يمكن أن يطبق هذا المنهج على أنواع أخرى من المياه تحتوي على مجموعة قليلة من الكائنات الحية الدقيقة المتداخلة، على سبيل المثال مياه المسبح والمياه الموجهة للاستهلاك البشري. .1 التعاريف لمتطلبات هذا المنهج، يطبق التعريف الآتي : 1-1 بسودوموناس أيروجينوزا هي أجسام دقيقة تنمو في أوساط انتقائية تحتوي على الستريميد وتشكل البيوسيانين، أو أجسام دقيقة تنمو في أوساط انتقائية تحتوي على الستريميد وأكسيداز إيجابية، وتعطي استشعاعا تحت تأثير الأشعة الفوق البنفسجية 360(+)20 نانومتر وقادرة كذلك على تشكيل الأمونياك انطلاقا من الأستميد. .2 المبدأ

2 . 1 الترشيح يرشح حجم مقدر من عينة الماء أو محلول مخفف من هذه العينة فوق غشاء الترشيح قطر مساماته 0,45 ميكرومتر.

ويوضع غشاء الترشيح فوق الوسط الانتقائي ويحضن في الشروط المحددة للوسط.

2 . 2 الإحصاء عدد بسودوموناس أيروجينوزا المفترضة يتحصل عليه بإحصاء عدد المستعمرات المميزة المتشكلة فوق غشاء الترشيح بعد التحضين وتعتبر ك "بسودوموناس أيروجينوزا" مؤكدة المستعمرات التي شكلت البيوسيانين إلا أن المستعمرات التي شكلت استشعاعا أو تلك التي لها لون أسمر محمر تتطلب تأكيدا.

2 . 3 التأكيد يعاد زرع المستعمرات المراد تأكيدها انطلاقا من الغشاء فوق علب تحتوي على وسط هلامي مغذ (الملاحظة ب). بعد التحضين يجرى اختبار البحث عن الأكسيداز على المزارع التي لم تظهر في البداية استشعاعا، ثم يجرى اختبار تشكيل الفليورسين على مزارع أكسيداز إيجابية وتفحص للكشف عن قدرتها المحتملة على تشكيل الأمونياك انطلاقا من الأستميد.

تفحص المزارع التي شكلت في البداية استشعاعا للكشف عن قدرتها المحتملة على تشكيل الأمونياك انطلاقا من الأستميد. .3 المخففات وأوساط الزرع والكواشف :

عدا تحديدات مخالفة، تستعمل لتحضير أوساط الزرع وا لمخففات، كواشف ذات نوعية تحليلة. يحضر الوسط كما يأتي وتضاف عوامل الانتقاء بالتراكيز المعطاة أو تستعمل الأوساط والكواشف المتوفرة في الأسواق ومحضرة طبقا لتعليمات المصنع. تحضر الأوساط والكواشف باستعمال ماء مقطر أو ماء ذي نقاوة مكافئة وخال من المواد القادرة على منع التكاثر في شروط التجربة.

3 . 1 وسط الزرع لتحديد بسودوموناس أيروجينوزا، يستعمل الوسط الآتي :

3 . 1 . 1 أساس هلامي لبسودوموناس / هلام (CN)

3 . 1 . 1 . 1 التركيب ببتون الجيلاتين … 16,0 غ حلامة الكازيين … 10,0 غ 13 أكتوبر سنة 2013 م س ول ف ات ال بوت اس ي وم خ ال من الماء …)K2SO4(10,0 غ كلورور المغنزيوم خ ال م ن ال ماء …)MgCI2(1,4 غ غليسيرول … 10 ملل هلام … 0,11 غ إلى 18,0 غ ماء (مقطر أو مكافئ 1000 …) ملل ملاحظة - تتوقف كمية الهلام اللازمة على قدرة التجمد، تتبع تعليمات مصنع الهلام المستعمل.

المضاف (CN) برومور هيكزاديسيل ثلاثي مثيل الأمونيوم (ستريميد) … 0,2 غ حمض نليديكسيك … 0,015 غ

3 . 1 . 1 . 2 التحضير يمزج كل من الببتون وحلامة الكازيين وسولفات البوتاسيوم وكلورور المغنزيوم والهلام في 1000 ملل من الماء المقطر (أو مكافىء)، يضاف 10 ملل من الغليسيرول، يغلى المزيج حتى الذوبان الكلي ويعقم في جهاز التعقيم لمدة 15 دقيقة في درجة 121(+)3 °م، يترك الوسط ليبرد في 45(إلى 50) °م.

يضاف المضاف (CN) المعاد تمييهه في 2 ملل من الماء المقطر المعقم، يخلط جيدا ويضاف إلى وسط الأساس معقم ومذوب. يمزج من جديد ويسكب في علب بتري معقمة بحيث يكون السمك الأدنى للهلام 5 ملم.

من الأحسن أن يكون العامل الهيدروجيني (pH) النهائي للوسط المتجمد مساو ل 7,1 + 0,2 في 25 °م، تحفظ العلب المحضرة بعيدا عن الضوء في درجة حرارة 5(+)3 °م، مع اجتناب كل تجفف، وتستعمل في أجل شهر واحد. يجب ألا يحفظ الهلام المذاب لأكثر من 4 ساعات، وألا يعاد تذويبه من جديد.

3 . 2 أوساط التأكيد والكواشف

3 . 2 . 1 وسط كينغ (B)

3 . 2 . 1 . 1 التركيب ببتون … 20,0 غ غليسيرول … 10 ملل هي دروج ي ن وف وس فات ال ب وت اس يوم )K2HPO4(… 1,5 غ 8 ذو الحجة عام 1434 ه الجريدة الرّسميّة 13 أكتوبر سنة 2013 م سول ف ات الم غ ن زي وم س ب اعي التمييه 7H2OMgSO4, … 1,5 غ هلام … 15,0 غ ماء (مقطر أو مكافئ) 1000 … ملل

3 . 2 . 1 . 2 التحضير تذاب المكونات في الماء بالتسخين يترك ليبرد في درجة حرارة 45(إلى °)50 م ويضبط العامل الهيدروجيني (pH) في 7,2 + 0,2 في 25 °م، باستعمال حمض الكلوريدريك أو هيدروكسيد الصوديوم.

يوزع الوسط بأجزاء تساوي 5 ملل في أنابيب زرع مسدودة ومعقمة في 121(+)3 °م لمدة 15 دقيقة.

تترك الأنابيب تبرد وتتجمد في وضعية مائلة.

تحفظ بعيدا عن الضوء في 5(+)3 °م وتستعمل في مدة ثلاثة (3) أشهر.

3 . 2 . 2 مرق الأستميد

3 . 2 . 2 . 1 التركيب محلول (A) ثنائي هيدروجينوفوسفات البوتاسيوم )KH2PO4(… 1,0 غ سولفات المغنيزيوم (خال من الماء) …)MgSO4(0,2 غ أستميد … 0,2 غ كلورور الصوديوم (NaCI) … 0,2 غ م اء (مق طر أو م كاف ىء، خال م ن الأمونياك) … 900 ملل تذاب المكونات في الماء ويضبط بعد ذلك العامل الهيدروجيني (pH) باستعمال إما حمض الكلوردريك أو هيدروكسيد الصوديوم في 7,0 + 0,5 في 25 °م.

ملاحظة : الأستميد مسبب للسرطان ومهيج، فيجب اتخاذ احتياطات خاصة أثناء الوزن والتحضير وعند التخلص من الوسط.

محلول (B) موليبدات الصوديوم )Na2MoO4,2H2O(0,5 … غ س ول ف ات الح ديد سباعي التمييه )FeSO4,7H2O(… 0,05 غ ماء … 100 ملل

3 . 2 . 2 . 2 التحضير لتحضير مرق الأستميد، يضاف 1 ملل من محلول

(B) ل 900 م لل م ن محل ول (A) حديث الت حض ي ر 3(. 2 . 2 . .)1 يضاف الماء مع رجّ مستمر حتى الحصول على حجم كلي يساوي 1 لتر.

يوزع هذا الخليط على أقسام تساوي 5 ملل في أنابيب الزرع. تسدّ الأنابيب وتعقّم في جهاز التعقيم في 121(+)3 °م لمدة 15 دقيقة. يحفظ بعيدا عن الضوء في 5(+)3 °م ويستعمل في مدة ثلاثة (3) أشهر.

3 . 2 . 3 هلام مغذ

3 . 2 . 3 . 1 التركيب ببتون … 5,0 غ مستخلص اللحم … 1,0 غ مستخلص الخميرة … 2,0 غ كلورور الصوديوم (NaCI) … 5,0 غ هلام … 15,0 غ ماء … 1000 ملل

3 . 2 . 3 . 2 التحضير تذوب المكونات في الماء بالتسخين. يعقم في جهاز التعقيم في 121(+)3 °م لمدة 15 دقيقة. من الأحسن أن يكون العامل الهيدروجيني (pH) للوسط المحضر بهذه الطريقة والمجمد يساوي 7,4 + 0,2 في 25 °م. تجفف العلب قبل الاستعمال لنزع الرطوبة الزائدة للسطح، تحفظ العلب المحضرة بهذه الطريقة بعيدا عن الضوء في 5(+)3 °م وتستعمل في أجل شهر.

3 . 2 . 4 كاشف للبحث عن الأكسيداز

3 . 2 . 4 . 1 التركيب ثنائي كلوريدرات رباعي المثيل - p - فنيلان ثنائي.

الأمين … 1,0 غ ماء … 10 ملل

3 . 2 . 4 . 2 التحضير مباشرة قبل الاستعمال، يذوب ثنائي كلوريدرات رباعي المثيل - P - فنيلان ثنائي الأمين في الماء ويحفظ بعيدا عن الضوء. بما أن هذا الكاشف غير مستقر فيجب تحضير كميات قليلة منه مباشرة قبل استعماله.

يمكن كذلك استعمال اختبارات الأكسيداز المتوفرة في الأسواق.

3 . 2 . 5 كاشف نسلر

3 . 2 . 5 . 1 التركيب كلورور زئبقي)HgCI2(… 10 غ إيودور البوتاسيوم (KI) … 7 غ هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) … 16 غ ماء (خال من الأمونياك) … حتى 100 ملل تذوب 10 غ من HgCI2 و 7 غ من KI في كمية قليلة من الماء، ثم يضاف هذا الخليط ببطء مع الرّج إلى محلول من الماء البارد يحتوي على 16 غ من NaOH مذوّب في 50 ملل من الماء، يخفف إلى 100 ملل، يحفظ في أدوات زجاجية من نوع "بوروسيليكاتي" مغلقة بسدادة من المطاط بعيدا عن ضوء الشمس لمدة أقصاها سنة.

ملاحظة : الكلورور الزئبقي)HgCI2(سام، يجب تجنب بلعه.

4 . التجهيزات والأدوات الزجاجية :

تستعمل الأجهزة المتداولة في مخابر الميكروبيولوجيا.

4 . 1 الأدوات الزجاجية :

قبل الاستعمال، تعقم جميع الأدوات الزجاجية في الفرن بدرجة 170(+)5 °م لمدة ساعة، أو في جهاز التعقيم بدرجة حرارة 121(+)3 °م لمدة 15 دقيقة.

4 . 2 جهاز التحضين، يمكن ضبطه في 36(+)2 °م.

4 . 3 مصباح ذو إشعاع فوق البنفسجي، يمكنه أن يصدر إشعاعا طول موجته 360(+)20 نانومتر.

4 . 4 أغشية الترشيح معمقة، قطر مساماتها 0,45 ميكرومتر.

5 . اقتطاع العينة يجرى اقتطاع العينة في الشروط الملائمة.

6 . طريقة العمل

6 . 1 عموميات 13 أكتوبر سنة 2013 م تطبق تقنية الترشيح فوق الغشاء المبينة في منهج الخطوط التوجيهية العامة لإحصاء الأجسام الدقيقة في وسط الزرع.

6 . 2 الترشيح فوق الغشاء ترشح أحجام من عينات الماء أو أجزاء من التخفيف فوق غشاء ترشيح معقم من أستر السيليلوز قطر مساماته 0,45 ميكرومتر. كما هو مبين في منهج الخطوط التوجيهية العامة لإحصاء الأجسام الدقيقة في وسط الزرع، يوضع كل غشاء فوق علبة بتري تحتوي على هلام مع مضاف (CN) 3(.)1 مع الحرص على عدم احتباس هواء تحت الغشاء.

6 . 3 تحضين العلب تحضن علب البت ري في 36(+)2 °م لمدة 44(+)4 سا في أوعية وتحفظ من كل تجفف.

6 . 4 فحص الأغشية تفحص الأغشية للتأك د من نمو ال مزارع بعد 22(+)2 سا و(44 +)4 سا.

تعد ك "بسودوموناس أيروجينوزا" مؤكدة جميع المستعمرات التي شكلت صبغ أزرق - مخضر (بيوسيانين).

تفحص الأغشية تحت الأشعة الفوق البنفسجية.

من الأحسن تجنب كل تعرض مطول للأشعة فوق البنفسجية لأن ذلك ي ؤدي إلى م وت المستعمرات، ما يعني ع دم نم وها ف وق أوس اط التأكيد. تعد ك "بسودوموناس أيروجينوزا" مفترضة المستعمرات التي لا تشكل البيوسيانين وتعطي استشعاعا وتؤكد هويتها باستعمال مرق الأستميد المبين لاحقا.

تعد ك "بسودوموناس أيروجينوزا" مفترضة جميع المستعمرات الأخرى التي شكلت صبغا أسمر محمر ولم تشكل استشعاعا وتؤكد هويتها باستعمال اختبار الأكسيداز ومرق الأستميد ووسط كينغ (B) المبين لاحقا. تجرى القراءة بعد 22(+)2 سا في حالة المستعمرات المجتاحة والتي تستطيع أن تظهر في مدة 44(+)4 سا. ينصح الأخذ بعين الاعتبار الإحصاء الأكبر لحساب عدد "بسودوموناس أيروجينوزا" المبينة في .(7) 8 ذو الحجة عام 1434 ه الجريدة الرّسميّة 13 أكتوبر سنة 2013 م يلخص الجدول 1 انتقاء المستعمرات ومراحل التأكيد.

جدول 1 - المراحل اللازمة لتأكيد المستعمرات التي تنمو فوق هلام .(CN) وصف الأمونياك تشكيل استشعاع بسودوموناس المستعمرات انطلاقا الأكسيداز فوق وسط أيروجينوزا فوق هلام من كينغ (B) مؤكدة (CN) الأسيتميد أزرق - غمأ غ م غ م نعم مخضر استشعاع + غ م غ م نعم غير أزرق - مخضر أسمر + + + نعم محمر نماذج أخرى غ م غ م غ م لا أغ م : غير مختبر

6 . 5 التأكيد

6 . 5 . 1 هلام مغذ يعاد زرع جميع المستعمرات التي تستوجب التأكيد انطلاقا من الغشاء وإذا تعذر ذلك، يعاد زرع أكبر قدر من المستعمرات (منهج الخطوط التوجيهية العامة لإحصاء الأجسام الدقيقة في وسط الزرع) وتحضن لمدة 22(+)2 سا في 36(+)2 °م. تفحص نقاوة المزارع وتخضع المستعمرات التي كانت في البداية سمراء محمّرة لاختبار الأكسيداز 6(. 5 . .)2

6 . 5 . 2 اختبار الأكسيداز للكشف عن الأكسيداز 3(. 2 .)4 تسكب 2 أو 3 قطرات من الكاشف المحضر جديدا فوق قطعة ورق ترشيح موضوعة فوق علبة بتري.

يوزع جزء من الزرع فوق ورق ترشيح محضر بواسطة مقبض معدني من البلاتين وليس من النيكل كروم أو من البلاستيك أو بواسطة عود أو ماصة من زجاج. يعتبر التفاعل إيجابي عند ظهور لون أزرق بنفسجي داكن في 10 ثوان. من الممكن استعمال اختبارات الأكسيداز المتوفرة في الأسواق بإتباع تعليمات المصنع.

6 . 5 . 3 وسط كينغ (B) يعاد زرع المستعمرات السمراء المحمّرة أكسيداز إيجابية المتحصل عليها في 6(. 5 .)1 فوق وسط كينغ

(B) وتح ضن لخمسة (5) أيام على الأكثر في درجة 36(+)2 °م.

يفحص الزرع يوميا تحت الأشعة الفوق البنفسجية ويسجل وجود استشعاع محتمل. تسجل كإيجابية كل استشعاع ظهر في 5 أيام.

6 . 5 . 4 مرق الأستميد يزرع أنبوب بواسطة الزرع المتحصل عليه في 6(. 5 .)1 ويحضن في 36(+)2 °م لمدة 22(+)2 سا.

تضاف قطرة أو قطرتان من كاشف نسلر 3(. 2 .)5 وتفحص الأنابيب للكشف عن تشكل محتمل للأمونياك الذي يظهر على شكل لون يتغير من الأصفر إلى الأحمر الأجوري حسب التركيز.

6 . 5 . 5 الإحصاء تعد ك "بسودوموناس أيروجينوزا" مؤكدة جميع المستعمرات التي شكلت البيوسيانين (صبغ أزرق - مخضر) أو أكسيداز إيجابية، تعطي استشعاعا تحت الأشعة الفوق البنفسجية 6(.)4 أو 6(. 5 .)3 وقادرة على تشكيل الأمونياك انطلاقا من الأستميد 6(. 5 . .)4 ملاحظة - المستعمرات التي أظهرت استشعاعا فوق الغشاء الأول تكون دائما أكسيداز إيجابية لذلك لاتحتاج أن تخضع إلى اختبار الأكسيداز (أنظر جدول .)1 .7 التعبير عن النتائج يحسب عدد "بسودوموناس أيروجينوزا" المؤكدة الموجودة في حجم معين من الماء انطلاقا من عدد المستعمرات المميزة المحصاة فوق الأغشية مع الأخذ بعين الاعتبار عدد تجارب التأكيد المنجزة. بالنسبة للماء المعدني وماء المنبع والمياه المعبأة، يكون الحجم 250 ملل، بالنسبة للمياه الأخرى يكون الحجم عموما 100 ملل.

يحسب عدد "بسودوموناس أيروجينوزا" في حجم عينة مختبرة من الماء كالآتي : )cR/nR(R +)cF/nF(P+F P : عدد المستعمرات الزرقاء - ا لمخضّرة، كلها محصاة كأهداف مؤكدة، F : عدد المستعمرات المستشعة، R : عدد المستعمرات السمراء المحمرّة، F n : عدد المستعمرات المستشعة التي كانت محل للكشف عن تشكيل الأمونياك، F c : عدد المستعمرات المستشعة التي شكلت الأمونياك، R n : عدد المستعمرات السمراء المحمّرة التي كانت محلا للكشف عن تشكل الأمونياك والبحث عن الأكسيداز والاستشعاع فوق وسط كينغ (B)، R c : عدد المستعمرات السمراء المحمّرة التي شكلت الأمونياك وأكسيداز إيجابية ومستشعة فوق وسط كينغ (B)، يمكن كذلك التعبير عن النتائج نوعيا بإظهار وجود أو غياب "بسودوموناس أيروجينوزا" في حجم الماء المدروس.

ملاحظة أ (معلومات إضافية عن بسودوموناس أيروجينوزا) بسودوموناس أيروجينوزا هي النوع النموذجي لجنس البسودوموناس.

وهي عبارة عن بكتيريا غرام سلبي، غير متبوغة وذات أكسيداز وكتلاز إيجابي. تظهر استقلاب تأكسدي كما هو مبين في تجربة هوق (Hugh) وليفسن (nosfieL)، ترجع بصفة عامة النترات من النتريت وتشكل الأمونياك نتيجة انحلال الأستميد.

تشكل معظم الأصناف (98)% صبغ مستشع ينحل في الم اء، كم ا أن م ع ظم أصولها قادرة على النمو في 42 °م لكن ليس في 4 °م، وهذا ما يميز بسودوموناس أيروجينوزا عن بسودوموناس فليوريسانس التي تنمو في 4 °م وليس في 42 °م.

تميّع الهلام وتحلل الكازيين لكن لا تحلل النشاء.

تشكل أكثر من 90 % من الأصناف صبغ البيوسيانين (أزرق - مخضر) ملاحظة ب أوساط أخرى يمكن استعمال أوساط أخرى غير الهلام المغذي بشرط ألا تكون انتقائية ولا تحتوي على هيدرات الكربون الذي يتخمر. 13 أكتوبر سنة 2013 م وزارة الصيد البحري والموارد الصيدية