Arrêté du 19 Joumada Ethania 1447 correspondant au 10 décembre 2025 rendant obligatoire la méthode de dosage enzymatique du saccharose dans les jus de fruits et de légumes, par technique spectrométrique par le nicotinamide-adénine-dinucléotidephosphate (NADP)

En application des dispositions de l’article 19 du décret exécutif n° 90-39 du 30 janvier 1990 susvisé, le présent arrêté a pour objet de rendre obligatoire la méthode de dosage enzymatique du saccharose dans les jus de fruits et de légumes, par technique spectrométrique par le nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate (NADP).

Pour le dosage enzymatique du saccharose dans les jus de fruits et de légumes, par technique spectrométrique par le nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate (NADP), les laboratoires de la répression des fraudes et les laboratoires agréés à cet effet doivent utiliser la méthode fixée à l’annexe jointe au présent arrêté.

Cette méthode doit être utilisée par le laboratoire lorsqu’une expertise est ordonnée. 7 juin 2026

Le présent arrêté sera publié au Journal officiel de la République algérienne démocratique et populaire.

Fait à Alger, le 19 Joumada Ethania 1447 correspondant au 10 décembre 2025.

Amel ABDELLATIF. ———————— Annexe Méthode de dosage enzymatique du saccharose dans les jus de fruits et de légumes

- Technique spectrométrique par le nicotinamide - adénine-dinucléotide-phosphate -

1. Domaine d’application :

La présente méthode spécifie une technique d'analyse enzymatique en vue de déterminer la teneur en saccharose dans les jus de fruits et de légumes, et de leurs produits dérivés.

2. Symboles et abréviations :

Pour les besoins de la présente méthode, les symboles et abréviations suivants s'appliquent :

- ATP : adénosine-5'- triphosphate ;

- ADP : adénosine-5'-diphosphate ;

- NADP : β-nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate ;

- NADPH : β-nicotinamide-adénine-dinucléotide-phosphate réduit ;

- G-6-P : glucose-6 -phosphate ;

- HK : hexokinase ;

- G6P-DH : glucose-6-phosphate déshydrogénase ;

- BF : β- fructosidase ;

UI : unité internationale qui correspond à la quantité d'enzyme qui, à 25 °C, catalyse la réaction de 1 μmol de substrat par minute ; c : concentration molaire ; ρ : concentration massique.

3. Principe et réactions : 3.1 Principe Le saccharose est hydrolysé (inverti) par voie enzymatique, par l'action de BF dans un échantillon pour essai dilué, pour obtenir des quantités égales de D-glucose et de D-fructose.

Le D-glucose formé est ensuite phosphorylé en position C-6 au cours d'une réaction enzymatique catalysée comprenant de l'ATP et du HK. 21 Dhou El Hidja 1447 JOURNAL OFFICIEL DE 7 juin 2026 Dans une réaction concomitante, le G-6-P est transformé stœchiométriquement en 6-phosphogluconate en présence de NADP ; la réaction est catalysée par l'enzyme G6P-DH, et il se forme une quantité de NADPH équivalente à la quantité de D-glucose présente dans l'échantillon pour essai (3.2).

La quantification du NADPH formé, et donc le dosage du D-glucose et du saccharose sont réalisés par spectrométrie.

Dans les jus contenant peu de saccharose (moins de 5 g/l) et davantage de glucose, il est impossible d'obtenir une quantification précise du saccharose par le dosage enzymatique classique. Dans ce cas, il convient d'éliminer le glucose, par réaction avec l'iode à un pH alcalin, avant la quantification du saccharose. 3.2 Réactions Saccharose + H2O BF D-glucose + D-fructose (1) Glucose + ATP HK G6P + ADP (2) G6P + NADP G6P - DH 6-phosphogluconat+NADPH+ H + T (3)

4. Réactifs :

N'utiliser que des réactifs d'une qualité analytique reconnue et de l'eau, au minimum, de qualité 3. 4.1 Solutions d’hydroxyde de sodium Les solutions d'hydroxyde de sodium sont préparées à des concentrations de c(NaOH) =5 mol/l, c(NaOH) = 4 mol/l et c(NaOH) = 2 mol/l. 4.2 Solution tampon de citrate, pH = 4,6 Dissoudre 6,9 g d'acide citrique monohydraté (C6H8O7, H2O) et 9,1 g de citrate trisodique dihydraté (C6H5Na3O7,2H2O) dans 150 ml d'eau, ajuster à pH = 4,6 avec une solution d'hydroxyde de sodium (c(NaOH) = 2 mol/l) (4.1) et compléter le volume avec de l’eau jusqu’à 200 ml. La solution tampon se conserve pendant, au moins, un an à + 4 °C. 4.3 Solution de BF Dissoudre 10 mg de β-fructosidase, ρ = 5 mg/ml, environ 750 UI/ml, dans 2 ml de solution tampon citrate (4.2). La solution se conserve pendant, au moins, une (1) semaine à + 4 °C. 4.4 Solution tampon de triéthanolamine, pH = 7,6 Dissoudre 14 g de chlorhydrate de triéthanolamine et 0,25 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4.7H2O) dans 80 ml d'eau, ajuster à pH = 7,6 avec environ 5 ml de solution d'hydroxyde de sodium (c(NaOH) = 5 mol/l ) et compléter le volume avec de l’eau jusqu’à 100 ml. La solution tampon se conserve pendant, au moins, quatre (4) semaines à + 4 °C.

LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 41 21 4.5 Solution de NADP Dissoudre 60 mg de sel disodique de β-nicotinamideadénine-dinucléotide-phosphate (β-NADP-Na2) dans 6 ml d'eau. Cette solution se conserve pendant, au moins, quatre (4) semaines à + 4 °C. 4.6 Solution de ATP Dissoudre 300 mg de sel disodique d'adénosine-5'-triphosphate (ATP-Na2H2.3H2O) et 300 mg d'hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3) dans 6 ml d'eau. Cette solution se conserve pendant, au moins, quatre (4) semaines à + 4 °C. 4.7 Suspension d’enzymes HK/G6P-DH Placer en suspension de l'hexokinase, ρ(HK) = 2 mg/ml, environ 280 UI/ml (le D-glucose servant de substrat en présence d'ATP) et de la G6P-DH, ρ (G6P-DH) = 1 mg/ml, environ 140 UI/ml (avec de la G-6-P comme substrat) dans une solution de sulfate d'ammonium, c((NH4)2SO4) = 3,2 mol/l. Cette suspension se conserve pendant, au moins, un an à + 4 °C. 4.8 Solution d’iode Dans une fiole jaugée d’une capacité de 1L, dissoudre 130 g d'iode et 150 g d'iodure de potassium dans une quantité suffisante d'eau ; après dissolution, compléter jusqu'au trait avec de l'eau. 4.9 Acide sulfurique Préparer une solution d'acide sulfurique de concentration c(H2SO4) = 0,5 mol/l, à partir d'une solution étalon appropriée concentrée. 4.10 Solution de sulfite de sodium Préparer une solution saturée de sulfite de sodium dans de l'eau (solubilité ρ (NA2SO3) = 12,54 g/100 ml à 0 °C et 28,3 g/100 ml à 80 °C).

Préparer une solution diluée en ajoutant neuf (9) volumes d'eau à un volume de solution concentrée. 4.11 Solution de phénolphtaléine Préparer une solution de phénolphtaléine (ρ = 0,5 g/100 ml) dans l'éthanol.

5. Appareillage :

Appareillage courant de laboratoire et, en particulier, les appareils suivants : 5.1 Pipettes pour analyse enzymatique, graduées uniquement le long de la tige, avec une longue extrémité d'écoulement non graduée. 5.2 Pipettes, d'une précision équivalente à celles du 5.1 (alternative à 5.1), par exemple pipettes capillaires à déplacement positif. 21 Dhou El Hidja 1447 5.3 Cuves en quartz, verre ou plastique, de 10 mm de trajet optique, et sans absorption significative aux longueurs d'onde considérées (par exemple 334 nm, 340 nm ou 365 nm). 5.4 Spectromètre à filtres, avec lampe à vapeur de mercure, pour les mesures aux longueurs d'onde de 334 nm ou de 365 nm. 5.5 Spectromètre (à longueur d'onde variable), pour les mesures à la longueur d'onde de 340 nm (alternative à 5.4).

6. Mode opératoire : 6.1 Préparation de l'échantillon pour essai 6.1.1 Préparation normale des échantillons Le jus de fruits doit être dilué de sorte que la teneur en saccharose et en glucose soit comprise entre 0,1 g/l et 1,5 g/l.

En générale, les produits ne doivent pas être prétraités, toutefois, une dilution pouvant se révéler nécessaire, leur analyse par cette méthode doit se faire sur une base volumétrique, les résultats étant exprimés par litre d'échantillon. L'analyse des produits concentrés peut, également se faire sur une base volumétrique après dilution à une densité relative connue.

Dans ce cas, la densité en question doit être indiquée.

L'échantillon étant pesé et en tenant compte du facteur de dilution dans l'analyse, on peut aussi exprimer les résultats par kilogramme de produit. Pour les produits très visqueux et/ou comportant une grande proportion de cellules (par exemple la pulpe), le mode opératoire habituel est de faire la détermination sur la base de la masse de l'échantillon pour essai.

Bien mélanger les échantillons troubles avant dilution ; il peut être nécessaire de diluer ces échantillons troubles, ainsi que ceux qui sont très colorés, plus que ne le requiert la teneur en saccharose. Clarifier au préalable les échantillons troubles contenant de très faibles concentrations de saccharose par centrifugation ou par filtration sur membrane à travers un filtre de 0,2 μm. 6.1.2 Préparation modifiée des échantillons pour la quantification du saccharose en présence d'une concentration élevée de glucose Diluer au cinquième le jus de fruit (clarifié par filtration ou par centrifugation, comme indiqué en (6.1.1)). Dans une fiole jaugée d’une capacité de 50 ml, ajouter à 10 ml du jus de fruit dilué/clarifié 10 ml de solution d'iode (4.8) et 2,5 ml de solution d'hydroxyde de sodium à 4 mol/l (4.1) ; [les solutions doivent être ajoutées dans cet ordre]. Laisser la fiole dix (10) minutes dans l'obscurité. Ajouter à cette solution 10 ml de solution d'acide sulfurique (4.9).

Eliminer l'excès d'iode en ajoutant les quantités nécessaires de solutions de sulfite de sodium saturées et diluées (4.10) et en agitant jusqu'à disparition de la couleur jaune/brun. 7 juin 2026 Ajuster le potentiel hydrogène de la solution à environ pH = 8 ou 9, par titration avec une solution d'hydroxyde de sodium à 4 mol/l (4.1) à l'aide d'une solution indicatrice de phénolphtaléine (4.11) jusqu'à persistance d'une couleur rose pâle. Cette solution doit être complétée à 50 ml, puis utilisée pour le dosage du saccharose. 6.2 Analyse 6.2.1 Généralités Le dosage doit être réalisé à une température constante comprise entre 20 °C et 25 °C, ou à une température constante inférieure ou égale à 37 °C, à condition que les résultats obtenus soient équivalents.

Le maximum d'absorption du NADPH se situe à une longueur d'onde de 340 nm. En cas d'utilisation d'un spectromètre à longueur d'onde variable, n'effectuer les mesures qu'au maximum d’absorption du NADPH. En cas d'utilisation d'un spectromètre à filtres équipé d'une lampe à vapeur de mercure, effectuer les mesures à la longueur d'onde de 334 nm ou de 365 nm.

Ne pas utiliser de pipettes à écoulement total (un trait) pour les échantillons indiqués ci-dessous. Les solutions d'enzyme, de coenzyme et de tampon peuvent être prélevées également avec des pipettes automatiques. Pour les solutions d'échantillon, utiliser des pipettes pour analyse enzymatique (5.1) ou leur équivalent (5.2).

Le dosage peut, également, être effectué avec une combinaison de réactifs prêts à l'emploi disponibles dans le marché.

Il est recommandé d'utiliser du saccharose comme solution étalon dans ce dosage. 6.2.2 Solution témoin pour dosage du saccharose Introduire dans les cuves, à l'aide d'une pipette, 0,20 ml de solution tampon de citrate (4.2) et 0,02 ml de solution BF (4.3). Mélanger, puis au bout de quinze (15) minutes ajouter 1 ml de solution tampon triéthanolamine (4.4), 1,70 ml d'eau, 0,1 ml de solution de NADP (4.5) et 0,1 ml de solution d’ATP (4.6).

Mélanger et, au bout de trois (3) minutes, lire l'absorbance (A1) de la solution par rapport à l'air (sans cuve dans le trajet optique). 6.2.3 Solution témoin pour dosage du glucose Introduire dans les cuves, à l'aide d'une pipette, 1ml de solution tampon (4.4), 1,92 ml d'eau, 0,1 ml de solution de NADP (4.5) et 0,1 ml de solution d’ATP (4.6). Mélanger et, au bout de trois (3) minutes, lire l'absorbance (A2) de la solution par rapport à l'air (sans cuve dans le trajet optique). 21 Dhou El Hidja 1447 JOURNAL OFFICIEL DE 7 juin 2026 6.2.4 Solution échantillon pour dosage du saccharose Introduire dans les cuves, à l'aide d'une pipette, 0,20 ml de solution tampon de citrate (4.2), 0,10 ml de solution d'échantillon et 0,02 ml de solution BF (4.3). Mélanger et conserver pendant quinze (15) minutes. Ajouter ensuite 1ml de solution tampon (4.4), 1,60 ml d'eau, 0,1 ml de solution de NADP (4.5) et 0,1 ml de solution d’ATP (4.6). Mélanger et, au bout de trois (3) minutes, lire l'absorbance (A3) des solutions par rapport à l'air (sans cuve dans le trajet optique). 6.2.5 Solution échantillon pour dosage du glucose Introduire dans les cuves, à l'aide d'une pipette, 0,10 ml de solution d'échantillon, 1 ml de solution tampon (4.4), 1,82 ml d'eau, 0,1 ml de solution de NADP (4.5) et 0,1 ml de solution d’ATP (4.6). Mélanger et, au bout de trois (3) minutes, lire l'absorbance (A4 ) de la solution par rapport à l'air (sans cuve dans le trajet optique). 6.2.6 Autre mode opératoire de dosage du saccharose après élimination du glucose libre Préparer un témoin pour dosage du saccharose comme décrit au (6.2.2), et une solution échantillon comme suit :

Introduire dans les cuves, à l'aide d'une pipette, 0,20 ml de solution tampon de citrate (4.2), 0,10 ml de solution d'échantillon traité (6.1.2) et 0,02 ml de solution BF (4.3).

Mélanger et conserver pendant quinze (15) minutes. Ajouter ensuite 1 ml de solution tampon (4.4), 1,60 ml d'eau, 0,1 ml de solution de NADP (4.5) et 0,1 ml de solution d’ATP (4.6).

Mélanger et, au bout de trois (3) minutes, lire l'absorbance (A9) des solutions par rapport à l'air (sans cuve dans le trajet optique). 6.2.7 Réaction enzymatique, quantification du saccharose Le mode opératoire suivant est appliqué à chaque solution (6.2.2), (6.2.3), (6.2.4), (6.2.5) et (6.2.6) individuellement.

Ajouter 0,02 ml de la suspension d'enzymes HK/G6P-DH (4.7). Bien mélanger, attendre l'arrêt de la réaction dix (10) à quinze (15) minutes et lire les absorbances des solutions (A5 pour (6.2.2), A6 pour (6.2.3), A7 pour (6.2.4), A8 pour (6.2.5) et A10 pour (6.2.6).

Contrôler l'achèvement de la réaction en répétant les mesures des absorbances finales à intervalles de deux (2) minutes au bout de quinze (15) minutes. Si la réaction n'est pas terminée dans ce délai et continue à augmenter de façon constante, extrapoler l'absorbance au temps de l'addition de la suspension d'enzymes HK/G6P-DH (4.7).

Note : Ce processus tient compte des réactions secondaires bien connues comme réactions parasites et présentées plus en détail en annexe A.

7. Expression des résultats :

D'après les réactions intervenant dans ce dosage, la quantité de NADPH formé (et donc la différence d'absorbance ΔA) est proportionnelle à la teneur en saccharose présent.

LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 41 23 ΔA saccharose = ΔA glucose total - ΔA glucose ......... (4) ΔA glucose total = (A8 – A3) échantillon saccharose - (A5 – A1) témoin saccharose ........................................... (5) ΔA glucose = (A7 – A4) échantillon glucose - (A6 – A2) témoin glucose ................................................................ (6) Si le glucose a été éliminé par réaction préalable avec l'iode, le calcul est simplifié et devient :

ΔA saccharose = (A10 – A9) échantillon saccharose – (A5– A1) témoin saccharose ........................................... (7) Le calcul de la teneur en saccharose en solution diluée, à partir de mesures d'absorption photométrique, dépend de la loi de Beer-Lambert.

La teneur en saccharose, ρ, exprimée en grammes par litre, est calculée selon la formule suivante :

M × V1 × F ρ = ΔA saccharose δ × ∈ ×V2 × 1000 Où :

M : est la masse moléculaire du saccharose (342,3 g/mol) ;

V1 : est le volume total de la solution dans la cuve, en millilitres ;

V2 : est le volume de la solution d'échantillon pour essai ajouté à la cuve, en millilitres ;

F : est le facteur de dilution de la solution d’échantillon (6.1.1 ou 6.1.2) ; δ : est le trajet optique de la cuve, en centimètres ; ∈ : est le coefficient d'extinction de NADPH :

- à 340 nm = 6,3 l mmol -1 cm -1 ;

- à 365 nm = 3,5 l mmol -1 cm -1 ;

- à 334 nm = 6,18 l mmol -1 cm -1 .

Δ A saccharose : est la différence d’absorbance.

Si le schéma de travail (6.2.2, 6.2.3, 6.2.4, 6.2.5 et 6.2.6) n'a pas été modifié, la teneur en saccharose, en grammes par litre, est calculée selon la formule suivante :

F x ΔA saccharose ρ = 10,34 x ∈ Exprimer la teneur en saccharose, en grammes par litre, avec une décimale.

Tenir compte du facteur de dilution et du mode d'expression par rapport à la masse ou au volume. Si un produit concentré a été dilué jusqu'à sa concentration initiale, prendre comme valeur la densité relative de l'échantillon de concentration initiale. 21 Dhou El Hidja 1447

8. Fidélité : 8.1 Répétabilité La différence absolue entre deux résultats d’essais individuels, obtenus sur une matière identique soumise à l’essai, par le même technicien utilisant le même appareillage et dans un court intervalle de temps, ne doit pas dépasser la valeur de répétabilité r dans plus de 5 % des cas.

Pour la préparation normale des échantillons (6.1.1), les valeurs sont les suivantes : jus de pomme r = 1,9 g/l ; nectar de cassis r = 3,2 g/l ; nectar d'abricot r = 3,9 g/l.

Pour la préparation modifiée des échantillons (6.1.2), la valeur est la suivante : r = 0,4 g/l 8.2 Reproductibilité La différence absolue entre deux résultats d’essais individuels obtenus sur une matière identique soumise à l’essai dans deux laboratoires ne doit pas dépasser la valeur de reproductibilité R dans plus de 5 % des cas.

Pour la préparation normale des échantillons (6.1.1), les valeurs sont les suivantes :

— jus de pomme R = 3,2 g/l ;

— nectar de cassis R = 5,6 g/l ;

— nectar d'abricot R = 6,9 g/l.

Pour la préparation modifiée des échantillons (6.1.2), la valeur est la suivante :

R = 0,9 g/l Annexe A Comment traiter les réactions parasites Les réactions parasites sont généralement dues à des réactions secondaires de l'enzyme, à la présence d'autres enzymes dans la matrice de l'échantillon, ou à l'interaction d'un ou plusieurs élément(s) de la matrice avec un réactif de la réaction enzymatique.

Dans la réaction normale, l'absorbance atteint une valeur constante au bout d'un certain temps, typiquement entre dix

(10) et vingt (20) minutes, selon la vitesse de la réaction enzymatique particulière. Cependant, lorsqu'il se produit des réactions secondaires, l'absorbance n'atteint pas une valeur constante, mais augmente régulièrement dans le temps ; ce type de processus est couramment appelé « réaction parasite ». 7 juin 2026 Si ce problème se pose, il convient de mesurer l'absorbance de la solution à intervalles réguliers (deux (2) à cinq (5) minutes) après le temps requis pour que la solution étalon atteigne son absorbance finale. Lorsque l'absorbance augmente à taux constant (dA/dT = constante), procéder à cinq (5) ou six (6) mesures, puis faire une extrapolation graphique ou par calcul, pour obtenir l'absorbance qui aurait été celle de la solution au moment où l'enzyme final a été ajouté (To). La différence d'absorbance extrapolée à ce moment (Af – Ai) est utilisée dans le calcul de la concentration du substrat.

Figure A.1 : Réaction parasite ————H————