Arrêté du 21 Moharram 1434 correspondant au 5 décembre 2012 rendant obligatoire la méthode de détection et de dénombrement de Pseudomonas aeruginosa dans l'eau par filtration sur membrane

En application des dispositions de l'article 19 du décret exécutif n° 90-39 du 30 janvier 1990, modifié et complété, susvisé, le présent arrêté a pour objet de rendre obligatoire la méthode de détection et de dénombrement de Pseudomonas aeruginosa dans l'eau par filtration sur membrane.

Pour la détection et le dénombrement de Pseudomonas aeruginosa dans l'eau par filtration sur membrane, les laboratoires du contrôle de la qualité et de la répression des fraudes et les laboratoires agréés à cet effet doivent employer la méthode jointe en annexe du présent arrêté.

Cette méthode doit être utilisée par le laboratoire lorsqu'une expertise est ordonnée.

Le présent arrêté sera publié au Journal officiel de la République algérienne démocratique et populaire.

Fait à Alger, le 21 Moharram 1434 correspondant au 5 décembre 2012.

Mustapha BENBADA. ——————— ANNEXE Méthode de détection et de dénombrement de Pseudomonas aeruginosa dans l'eau par filtration sur membrane La présente méthode spécifie une technique permettant d'isoler et de dénombrer Pseudomonas aeruginosa dans des échantillons d'eau embouteillée, par filtration sur 13 octobre 2013 membrane. Cette méthode peut également être appliquée à d'autres types d'eau présentant une faible flore interférente, par exemple les eaux de piscine et les eaux destinées à la consommation humaine.

1. DÉFINITION Pour les besoins du présent document, la définition suivante s'applique. 1.1 Pseudomonas aeruginosa Micro-organismes se développant sur des milieux sélectifs contenant du cétrimide et produisant de la pyocyanine ou micro-organismes se développant sur des milieux sélectifs contenant du cétrimide, oxydase positive, donnant lieu à une fluorescence sous rayonnement ultraviolet (360 ± 20) nm et également capables de produire de l'ammoniac à partir d'acétamide.

2. PRINCIPE 2.1 Filtration Un volume mesuré de l'échantillon d'eau ou une dilution de l'échantillon est filtré sur une membrane filtrante de porosité 0,45 μm. La membrane filtrante est placée sur le milieu sélectif et incubée dans les conditions spécifiées pour le milieu. 2.2 Dénombrement Le nombre de Pseudomonas aeruginosa présumés est obtenu par comptage du nombre de colonies caractéristiques formées sur la membrane filtrante après incubation. Les colonies produisant de la pyocyanine sont considérées comme Pseudomonas aeruginosa confirmés mais les colonies qui produisent une fluorescence ou celles de couleur brun rougeâtre nécessitent une confirmation. 2.3 Confirmation Repiquage des colonies à confirmer à partir de la membrane sur des boîtes de gélose nutritive (mais voir annexe B). Après incubation, les cultures qui ne présentaient initialement pas de fluorescence sont soumises au test de recherche de l'oxydase, puis les cultures oxydase positive sont soumises au test de production de fluorescéine et examinées pour déceler leur aptitude éventuelle à produire de l'ammoniac à partir d'acétamide.

Les cultures qui présentaient initialement une fluorescence sont examinées pour déceler leur aptitude éventuelle à produire de l'ammoniac à partir d'acétamide.

3. DILUANTS, MILIEUX DE CULTURE ET RÉACTIFS Sauf spécifications contraires, utiliser des réactifs de qualité analytique pour la préparation des milieux de culture et des diluants. Préparer le milieu comme suit et ajouter les agents sélectifs aux concentrations données ou utiliser des milieux et réactifs disponibles dans le commerce, préparés conformément aux instructions du fabricant. Préparer les milieux et réactifs en utilisant de l'eau distillée ou de l'eau de pureté équivalente et exempte de substances pouvant inhiber la croissance dans les conditions de l'essai. 8 Dhou El Hidja 1434 JOURNAL OFFICIEL DE 13 octobre 2013 3.1 Milieu de culture Pour déterminer Pseudomonas aeruginosa, utiliser le milieu suivant : 3.1.1 Base gélosée pour Pseudomonas gélose CN 3.1.1.1 Composition Peptone de gélatine................................................16,0 g Hydrolysat de caséine............................................10,0 g Sulfate de potassium (Anhydre) (K2SO4)................................................10,0 g Chlorure de magnésium (Anhydre) (MgCl2)..................................................1,4 g Glycérol..................................................................10 ml Gélose.......................................................11,0 g à 18,0 g Eau (distillée ou équivalent)..............................1 000 ml Note — La quantité de gélose requise dépend du pouvoir gélifiant. Respecter les instructions du fabricant de la gélose utilisée.

Supplément CN Bromure d'hexadécyltriméthyl ammonium (cétrimide)...................................................................0,2 g Acide nalidixique.................................................0,015 g 3.1.1.2 Préparation Mettre en suspension la peptone, l'hydrolysat de caséine, le sulfate de potassium, le chlorure de magnésium et la gélose dans 1 000 ml d'eau distillée (ou l'équivalent).

Ajouter 10 ml de glycérol. Porter à ébullition jusqu'à dissolution complète et stériliser à l'autoclave à (l21±3) °C pendant 15 min. Laisser le milieu refroidir à (45 à 50) °C.

Ajouter le supplément CN réhydraté dans 2 ml d'eau distillée stérile, bien mélanger et ajouter au milieu de base stérile fondu. Mélanger de nouveau et verser dans des boîtes de Petri stériles de façon à obtenir une épaisseur minimale de gélose de 5 mm. Il convient que le pH final du milieu solidifié soit égal à 7,1 ± 0,2 à 25 °C. Conserver les boîtes ainsi préparées à l'abri de la lumière, en évitant toute dessiccation, à une température de (5 ± 3) °C et les utiliser dans un délai d'un mois. Ne pas conserver la gélose fondue pendant plus de 4 h. Ne pas faire fondre de nouveau le milieu. 3.2 Milieux de confirmation et réactifs 3.2.1 Milieu de King B 3.2.1.1 Composition Peptone...................................................................20,0 g Glycérol...................................................................10 ml Hydrogénophosphate de potassium (K2HPO4)...........................................1,5 g Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4,7H2O).........................................................1,5 g Gélose.....................................................................15,0 g Eau (distillée ou équivalent)..............................1 000 ml LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 51 23 3.2.1.2 Préparation Dissoudre les composants dans l'eau par chauffage.

Laisser refroidir à une température de (45 à 50) °C et ajuster le pH à 7,2 ± 0,2 à 25 °C, en utilisant soit de l'acide chlorhydrique, soit de l'hydroxyde de sodium. Répartir le milieu en aliquotes de 5 ml dans des tubes de culture bouchés et autoclavés à (121 ± 3) °C pendant 15 min.

Laisser les tubes refroidir et se solidifier en position inclinée.

Conserver à l'abri de la lumière à (5 ± 3) °C et les utiliser dans les trois (3) mois. 3.2.2 Bouillon d'acétamide 3.2.2.1 Composition Solution A Dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4)................................................1,0 g Sulfate de magnésium (anhydre) (MgSO4).............0,2 g Acétamide................................................................2,0 g Chlorure de sodium (NaCI).....................................0,2 g Eau (distillée ou équivalent, exempte d'ammoniac)..............................................................900 ml Dissoudre les composants dans l'eau et ajuster ensuite le pH à 7,0 ± 0,5, à 25 °C, en utilisant soit de l'acide chlorhydrique, soit de l'hydroxyde de sodium.

Attention - L'acétamide est cancérigène et irritant.

Des précautions particulières doivent donc être prises lors de la pesée, de la préparation et de la mise au rebut du milieu.

Solution B Molybdate de sodium (Na2MoO4, 2H2O)...................................................0,5 g Sulfate de fer heptahydraté (FeSO4,7H2O)........................................................0,05 g Eau........................................................................100 ml 3.2.2.2 Préparation Pour préparer le bouillon d'acétamide, ajouter 1 ml de la solution (B) à 900 ml d'une solution (A) fraîchement préparée (3.2.2.1). Ajouter de l'eau sous agitation constante jusqu'à obtention d'un volume total de 1 litre.

Répartir ce mélange en aliquotes de 5 ml dans des tubes de culture. Boucher les tubes et les stériliser à l'autoclave à (121 ± 3) °C pendant 15 min. Conserver à l'abri de la lumière à (5 ± 3) °C et les utiliser dans les trois (3) mois. 3.2.3 Gélose nutritive 3.2.3.1 Composition Peptone.....................................................................5,0 g Extrait de viande......................................................1,0 g Extrait de levure.......................................................2,0 g Chlorure de sodium (NaCl)......................................5,0 g Gélose.....................................................................15,0 g Eau.....................................................................1 000 ml 3.2.3.2 Préparation Dissoudre les composants dans l'eau par chauffage.

Stériliser à l'autoclave à (121 ± 3) °C pendant 15 min. Il convient que le pH du milieu ainsi préparé et solidifié soit égal à 7,4 ± 0,2 à 25 °C. Sécher les boîtes pour éliminer toute humidité excessive de la surface, avant utilisation.

Conserver les boîtes ainsi préparées à l'abri de la lumière à (5 ± 3) °C et les utiliser dans un délai d'un mois. 3.2.4 Réactif pour la recherche de l'oxydase 3.2.4.1 Composition Dichlorhydrate detétraméthyle-pphénylènediamine.....................................................0,1 g Eau..........................................................................10 ml 3.2.4.2 Préparation Immédiatement avant utilisation, dissoudre le dichlorhydrate de tétraméthyle-p-phénylènediamine dans l'eau et mettre à l'abri de la lumière. Ce réactif n'étant pas stable, le préparer en petites quantités juste avant de l'utiliser.

Il est également possible d'utiliser des tests oxydase disponibles dans le commerce. 3.2.5 Réactif de Nessler 3.2.5.1 Composition Chlorure mercurique (HgCi2)....................................10 g Iodure de potassium (KI).............................................7 g Hydroxyde de sodium (NaOH).................................16 g Eau (exempte d'ammoniac).......................jusqu'à 100 ml Dissoudre 10g de HgCi2 et 7 g de KI dans une petite quantité d'eau, puis en agitant, ajouter ce mélange lentement à une solution d'eau froide de 16 g de NaOH dissous dans 50 ml d'eau. Diluer à 100 ml. Conserver dans de la verrerie borosilicatée fermée par un bouchon en caoutchouc à l'abri de la lumière du soleil, pendant une durée maximale d'un an.

Note : Le chlorure mercurique (HgCl2) est toxique - éviter toute ingestion.

4. APPAREILLAGE ET VERRERIE Utiliser le matériel courant des laboratoires de microbiologie. 4.1 Verrerie Avant utilisation, stériliser toute la verrerie à (170 ± 5) °C pendant 1 h, au four ou à (121 ± 3) °C pendant 15 min, à l'autoclave. 4.2 Incubateur, réglable à (36 ± 2) °C. 4.3 Lampe à rayonnement ultraviolet, pouvant émettre un rayonnement d'une longueur d'onde de (360 ± 20) nm. 13 octobre 2013 4.4 Membranes filtrantes stériles, ayant une porosité nominale de 0,45 μm.

5. ECHANTILLONNAGE L'échantillonnage se fait dans les conditions appropriées.

6. MODE OPÉRATOIRE 6.1 Généralités Appliquer la technique de filtration sur membrane décrite dans la méthode de dénombrement des micro-organismes sur milieu de culture, lignes directrices générales. 6.2 Filtration sur membrane Filtrer des volumes de l'échantillon d'eau ou des portions d'une dilution sur une membrane filtrante stérile en esters de cellulose de diamètre de pore nominal de 0,45 μm. Comme spécifié dans la méthode de dénombrement des micro-organismes sur milieu de culture, lignes directrices générales, placer chaque membrane sur une boîte de Petri contenant de la gélose avec supplément CN (3.1) en veillant à ne pas emprisonner d'air sous la membrane. 6.3 Incubation des boîtes Incuber les boîtes de Petri à (36 ± 2) °C pendant (44 ± 4) h dans des récipients et protéger contre toute dessiccation. 6.4 Examen des membranes Examiner les membranes pour vérifier la croissance des cultures après (22 ± 2) h et (44 ± 4) h.

Compter toutes les colonies produisant une pigmentation bleu-vert (pyocyanine) comme Pseudomonas aeruginosa confirmés.

Examiner les membranes sous rayonnement ultraviolet. Il convient d'éviter toute exposition prolongée à l'éclairage UV car les colonies peuvent être tuées et donc ne pas se développer sur les milieux de confirmation. Compter les colonies ne produisant pas de pyocyanine et donnant lieu à une fluorescence comme Pseudomonas aeruginosa présumés et confirmer leur identité en utilisant le bouillon d'acétamide décrit ci-après.

Compter toutes les autres colonies produisant une pigmentation brune-rougeâtre et ne produisant pas de fluorescence comme Pseudomonas aeruginosa présumés et confirmer leur identité en utilisant un test oxydase, le bouillon d'acétamide et le milieu de King B décrit ci-après. La lecture après (22 ± 2) h est réalisée dans le cas de colonies envahissantes, lesquelles peuvent apparaître au bout de (44 ± 4) h. Il est recommandé de prendre en compte le dénombrement le plus élevé pour calculer le nombre de « Pseudomonas aeruginosa » décrit en (7).

Le Tableau 1 récapitule la sélection des colonies et les étapes de confirmation. 8 Dhou El Hidja 1434 JOURNAL OFFICIEL 13 octobre 2013 Tableau 1 - Étapes requises pour la confirmation des DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 51 25 colonies se développant sur la gélose CN Description des colonies Ammoniac à partir Production Fluorescence sur Confirmés comme sur gélose CN d’acétamide d’oxydase milieu King B Pseudomonas aeruginosa Bleu-vert NTa Fluorescence + (pas bleu-vert) Brun rougeâtre + Autres types NT a NT : Non testé. 6.5 Confirmation 6.5.1 Gélose nutritive Repiquer toutes les colonies nécessitant une confirmation ou, si cela est irréalisable, autant de colonies que possible (la méthode de dénombrement des micro-organismes sur milieu de culture, lignes directrices générales à partir de la membrane et incuber pendant (22 ± 2) h à (36 ± 2) °C). Vérifier la pureté des repiquages et soumettre les colonies initialement brunes-rougeâtres au test de recherche de l'oxydase (6.5.2). 6.5.2 Test oxydase Verser 2 ou 3 gouttes de réactif pour la recherche de l'oxydase (3.2.4) fraîchement préparé sur un morceau de papier-filtre placé dans une boîte de Petri.

À l'aide d'une anse métallique en platine (pas en Nichlechrome) ou en plastique, d'une baguette ou d'une pipette en verre, étaler une partie de la culture sur le papier-filtre préparé. La réaction est considérée comme positive lorsqu'une coloration bleu-pourpre foncé apparaît dans les 10 s. Il est également possible d'utiliser des tests oxydase disponibles dans le commerce en suivant les instructions du fabricant. 6.5.3 Milieu de King B Repiquer les colonies brunes rougeâtres oxydase positive obtenues en (6.5.1) sur un milieu de King B et incuber cinq jours au plus, à une température de (36 ± 2) °C. Examiner quotidiennement la culture sous un rayonnement UV et noter la présence d'une éventuelle fluorescence. Enregistrer comme positive toute fluorescence apparue dans les cinq jours. 6.5.4 Bouillon d'acétamide Ensemencer un tube à l'aide du repiquage obtenu en (6.5.1) et incuber à (36 ± 2) °C pendant (22 ± 2) h.

Ajouter 1 ou 2 gouttes de réactif de Nessler (3.2.5) et examiner les tubes afin de déceler une production éventuelle d'ammoniac se traduisant par une coloration allant du jaune au rouge brique, selon la concentration.

NT NT OUI NT NT OUI + + OUI NT NT NON 6.5.5 Dénombrement Compter comme « Pseudomonas aeruginosa » confirmés toutes les colonies produisant de la pyocyanine (pigmentation bleu-vert) ou oxydase positive, donnant lieu à une fluorescence sous rayonnement UV (6.4) et (6.5.3.) et capables de produire de l'ammoniac à partir d'acétamide (6.5.4).

Note — Les colonies qui présentent une fluorescence sur la première membrane sont toujours oxydase positive et n'ont donc pas besoin d'être soumises au test oxydase (Tableau 1).

7. EXPRESSION DES RESULTATS A partir du nombre de colonies caractéristiques dénombrées sur les membranes et en tenant compte du nombre d'essais de confirmation réalisés, calculer le nombre de « Pseudomonas aeruginosa » confirmés présents dans un volume d'eau déterminé. Pour l'eau minérale, l'eau de source et les autres eaux en bouteille, le volume est de 250ml. Pour les autres eaux, le volume est généralement de 100 ml.

Calculer le nombre de « Pseudomonas aeruginosa » par volume d'échantillon d'eau étudié comme suit :

P + F ( cF / nF ) + R ( cR / nR ) P : est le nombre de colonies bleu-vert, toutes ayant été comptées comme cibles confirmées ;

F : est le nombre de colonies fluorescentes ;

R : est le nombre de colonies brun rougeâtre ; nF : est le nombre de colonies fluorescentes ayant fait l'objet d'une détection de production d'ammoniac ; cF : est le nombre de colonies fluorescentes ayant produit de l'ammoniac ; nR : est le nombre de colonies brun rougeâtre ayant fait l'objet d'une détection de production d'ammoniac, d'une recherche de l'oxydase et de fluorescence sur le milieu de King B ; cR : est le nombre de colonies brun rougeâtre ayant produit de l'ammoniac, oxydase positive et fluorescentes sur le milieu de King B.

Une autre solution consiste à exprimer les résultats qualitativement en indiquant la présence ou l'absence de « Pseudomonas aeruginosa » dans le volume d'eau étudié.

Note A Informations complémentaires sur « Pseudomonas aeruginos »

Pseudomonas aeruginosa est l'espèce type du genre Pseudomonas.

C'est une bactérie Gram négative, non sporulée, oxydase positive et catalase positive. Elle présente un métabolisme oxydatif tel qu'indiqué par l'essai selon Hugh et Leifson, réduit généralement les nitrates au-delà des nitrites et produit de l'ammoniac à partir de la dégradation de l'acétamide.

La plupart des souches (98 %) produisent un pigment fluorescent soluble dans l'eau. La majorité des souches sont capables de croître à 42 °C mais pas à 4 °C, ce qui différencie « Pseudomonas aeruginosa » de « Pseudomonas fluorescens » qui croît à 4 °C et non à 42 °C. Elle liquéfie la gélatine et hydrolyse la caséine mais pas l'amidon. Plus de 90 % des souches produisent le pigment pyocyanine (bleu-vert).

Note B Autres milieux Il est possible d'utiliser d'autres milieux que la gélose nutritive à condition qu'ils ne soient pas sélectifs et qu'ils ne contiennent pas d'hydrate de carbone fermentescible.

MINISTERE DE LA PECHE ET DES RESSOURCES HALIEUTIQUES