قرار مؤرخ في 10 رمضان عام 1433 الموافق 29 يوليو سنة 2012، يجعل المنهج الأفقي لإحصاء البكتيريا المرجعة للسلفيت النامية في شروط لا هوائية، إجباريا

تطبيقا لأحكام المادة 19 من المرسوم التنفيذي رقم 90-39 المؤرخ في 3 رجب عام 1410 الموافق 30 يناير سن ة 1990، المعدّل والمتمّم والمذكور أعلاه، يهدف هذا القرار إلى جعل المنهج الأفقي لإحصاء البكتيريا المرجعة للسلفيت النامية في شروط لاهوائية إجباريا.

من أجل إحصاء البكتيريا المرجعة للسلفيت النامية في شروط لا هوائية، فإن مخابر مراقبة الجودة وقمع الغش وتلك المعتمدة لهذا الغرض، ملزمة باستعمال المنهج المبين في الملحق المرفق بهذا القرار.

يجب أن يستعمل هذا المنهج من طرف المخبر عند الأمر بإجراء خبرة.

ينشر هذا القرار في الجريدة الرسمية للجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية.

حرر بالجزائر في 10 رمضان عام 1433 الموافق 29 يوليو سنة .2012 مصطفى بن بادة الملحق المنهج الأفقي لإحصاء البكتيريا المرجعة للسلفيت النامية في شروط لا هوائية يبين هذا المنهج الطريقة الأفقية لإحصاء البكتيريا المرجعة للسلفيت النامية في شروط لا هوائية ويطبق في :

- المواد الموجهة لتغذية الإنسان والحيوان،

- عيّنات المحيط في مجال الإنتاج وتوزيع الأغذية.

1 . تعريف لاحتياجات هذا المنهج، يطبق التعريف الآتي.

1 . 1 بكتيريا مرجعة للسلفيت النامية في شروط لا هوائية بكتيريا مشكلة لمستعمرات نموذجية محصاة في شروط محدّدة في هذا المنهج.

2 . المبدأ

2 . 1 الزرع في الكتلة لعلبتي بيتري (أولأنبوبين) لوسط من سلفيت الحديد مع كمية محددة من العينة للتجربة إذا كان المنتوج الأولي سائلا، أو مع كمية محددة من المحلول الأم في حالة المنتوجات الأخرى.

تحضّر علبتان أخريان (أو أنبوبان) من الهلام في نفس الشروط، مع تخفيفات عشرية لعينة للتجربة أو المحلول الأم.

2 . 2 تحضن العلب (أو الأنابيب) في شروط لاهوائية في درجة حرارة °37 م + °1 م من 24 ساعة إلى 48 ساعة (القراءة الأخيرة خلال 48 ساعة)، عند الاقتضاء، في درجة حرارة 50 ° م عند الاشتباه بوجود بكتيريا مقاومة للحرارة. تحصى المستعمرات المميزة بلون أسود. يعود اللون الأسود للمستعمرات وما حولها إلى تشكل سلفيت الحديد )II( الناتج عن التفاعل بين الأيونات المكبرتة وأيونات الحديد ثلاثي التكافؤ [ )III( Fe ] الموجود في الوسط.

2 . 3 حساب عدد البكتيريا المرجعة للسلفيت بالمليلتر أو بالغرام من العينة، انطلاقا من عدد المستعمرات المتحصل عليها في العلب (أو الأنابيب).

3 . وسط الزرع والمخفف

3 . 1 هلام الإحصاء : هلام بسلفيت الحديد

3 . 1 . 1 التركيبة عصارة أنزيمية من الكازيين 15 غ عصارة أنزيمية من الصوجا 5 غ مستخلص الخميرة 5 غ ثاني سلفيت الصوديوم O5( S2 )Na2 1 غ سيترات الحديد )III( الأمونياك 1 غ أغار - أغار 9 غ إلى 18 غ أ الماء 1000 ملل أ حسب قدرة تخثر الأغار - أغار

3 . 1 . 2 التحضير تذوب المقادير في الماء بالتسخين. إذا اقتضى الأمر، يعدل العامل الهيدروجيني )pH( بحيث يكون بعد التعقيم 7,6 + 0,2 في درجة حرارة 25 °م.

تسكب حصص من 250 ملل من الوسط في قارورات ذات 500 ملل. 13 أكتوبر سنة 2013 م إذا أجري الإحصاء بواسطة أنابيب (4.5)، يسكب 20 ملل إلى 25 ملل من الوسط في الأنابيب. يعقّم في جهاز التعقيم مدة 15 دقيقة في درجة حرارة 121 °م.

يفرغ الوسط من الهواء مباشرة قبل استعماله.

3 . 2 المخفف بيبتون - ملح.

4 . الأجهزة والأدوات الزجاجية اللوازم المعتادة في مخابر الأحياء الدقيقة وبالخصوص ما يأتي :

4 . 1 جهاز ا لمجانسة، لعينات الأغذية الصلبة

4 . 2 حمام مائي، يمكن ضبطه في درجة حرارة محصورة بين 44 °م و 47 °م.

4 . 3 جرر للشروط اللاهوائية، مجهزة بمعدات تسمح بتوليد وسط لا هوائي، ويحتوي على نظام مراقبة الشروط اللاهوائية.

4 . 4 جهاز الحضن، يمكن ضبطه في درجة حرارة 37 °م + 1 °م، وفي 50 °م + 1 °م إذا اقتضى الأمر.

4 . 5 أنابيب اختبار، ذات أبعاد 16 ملم x 160 ملم، وحوجلات أو قارورات سعتها 500 ملل.

5 - اقتطاع العينة من المهم أن يتلقى المخبر عينة مثالية، غير معيبة أو متغيرة عند النقل أو التخزين.

6 . طريقة العمل لتحضير العينة للتجربة

6 . 1 عموميات يعطى التمثيل البياني لطريقة العمل في الجدول المبين أدناه.

6 . 2 العيّنة المأخوذة للتجربة، المحلول الأم والتخفيفات من الممكن أن يكون ضروريا، إجراء معالجة حرارية للمحلول الأم للتخلص من الأشكال الجذرية للبكتيريا المشكلة لأبواغ و/أو البكتيريا غير المتبوعة.

تتغير دراجات الحرارة ومدة التسخين حسب الحاجيات، 8 ذو الحجة عام 1434 ه الجريدة الرّسميّة 13 أكتوبر سنة 2013 م تتراوح بدءا من اندماجات منتجة لأثر بسترة واضح إلى عمل لتنشيط الأبواغ بالحرارة (على سبيل المثال 75 °م خلال 20 دقيقة) وحتى الغلي لعدة دقائق.

في هذه الحالة، يمكن أن تعطى النتيجة بعد أبواغ البكتيريا المرجعة للسلفيت النامية في شروط لاهوائية.

6 . 3 الزرع تأخذ علبتي بيتري معقمتين. بواسطة ماصة معقمة، ينقل في كل علبة 1 ملل من العيّنة للتجربة إذا كان المنتوج المراد اختباره سائلا، أو 1 ملل من المحلول الأم للمنتوجات الأخرى.

تأخذ علبتي بيتري أخريين معقمتين. بواسطة ماصة أخرى معقمة، ينقل 1 ملل من المخفف العش ري الأول 10( - )1 من العينة للتجربة إذا كان المنتوج سائلا، أو 1 ملل من المخفف العشري الثاني 10( - )2 من المحلول الأم للمنتوجات الأخرى.

يعاد الإجراء الموصوف مع التخفيفات التي تلي، باستعمال ماصة معقمة جديدة لكل تخفيف.

يضاف لكل علبة بيتري حوالي 15 ملل من هلام بسلفيت الحديد 3( . )1 مبّرد بواسطة حمام مائي 4( . )2 في درجة حرارة محصورة بين 44 °م و 47 °م. من الأنسب عدم تجاوز المدة بين زرع علب بيتري وإضافة الوسط الهلامي 15 دقيقة.

يمزج التطعيم جيدا مع الوسط الهلامي بواسطة حركات أفقية، ثم يترك الوسط ليتجمد.

بعد تجمد الوسط، يسكب في علبة من 5 ملل إلى 10 ملل من نفس الوسط، بحيث تغطى الطبقة السابقة.

في حالة استعمال الأنابيب، يلقح 1 ملل من كل من التخفيفات في كل من الأنبوبين المحتويين على الوسط الهلامي، يحفظ في درجة حرارة محصورة بين 44 °م و 47 °م.

يمزج بلطف مع اجتناب تشكل فقاعات هوائية، ثم يترك الوسط ليتجمد بواسطة حمام مائي 4( . .)2 بعد أن يتجمد الوسط، يسكب 2 ملل إلى 3 ملل من نفس الوسط في كل أنبوب، بحيث تغطى الطبقة السابقة.

6 . 4 الحضن بعد التجمد، تحضن علب البيتري داخل جرر لشروط لا هوائية 4( . )3 في درجة حرارة 37 °م + 10 °م، من 24 إلى 48 ساعة.

إذا اشتبه في وجود بكتيريا مقاومة للحرارة، تحضر سلسلة ثانية من علب بيتري (أنظر 6 . .)3 تحضن هذه العلب في درجة حرارة 50 °م + 1 °م.

إذا استعملت أنابيب، يكون الحضن في الجرر في الشروط اللاهوائية غير ضروري.

6 . 5 حساب المستعمرات تقرأ النتائج بعد 24 ساعة وبعد 48 ساعة، حسب درجة التلوين الأسود ونسبة نمو الكائنات الدقيقة.

تحصى المستعمرات السوداء المحتمل أنها محاطة بمنطقة سوداء كبكتيريا مرجعة للسلفيت.

ملاحظة 1 - يمكن أن ينتج اسوداد منتشر وغير نوعي للوسط، لا سيما عندما يجرى التلقيح في أنابيب من الهلام بدلا من علب البيتري. يمكن أيضا لنمو البكتيريا اللاهوائية المنتجة للهيدروجين فقط (ليس )H2S أن يرجع السلفيت الموجود وإحداث اسوداد عام للوسط.

تحصى المستعمرات المرجعة للسلفيت في كل علبة تحتوي على أقل من 150 مستعمرة مميزة وأقل من 300 مستعمرة بالإجمال.

يمكن أن تكون الأعداد المحددة أعلاه جد مرتفعة بالنسبة للأنابيب، في هذه الحالة لا تأخذ بعين الاعتبار إلا الأنابيب التي تكون بداخلها المستعمرات المعزولة تماما.

ملاحظة 2 - هيأ هذا المنهج أيضا لإحصاء الكلوستريديا لوحدها. في هذه الحالة بعد الحصول على مستعمرات مميزة، تقتطع خمس من بينها داخل كل علبة مستعملة، ثم يثبت نمط الكلوستريديوم بواسطة تجارب الإثبات (على سبيل المثال تجارب حول القدرة التنفسية، حول تشكل الأبواغ).

الجدول التمثيل البياني لطريقة العمل x1 غ من العينة المأخوذة للتجربة + 9 x غ من المخفف معالجة حرارية للتخلص من المحلول الأم البكتيريا الجذرية (أنظر 6 . )2 للحصول على النتيجة بعدد أبواغ البكتيريا أو بعدد أبواغ الكلوستريديا المقاومة للحرارة التخفيف (أنظر 6 . )2 (أنظر الملاحظة 2 في 6 . )5 في حالة الاشتباه في البكتيريا المقاومة هلام بسلفيت الحديد 3( . .)1 للحرارة (أنظر 6 . )4 الحضن في درجة حرارة 37 °م + 1 °م، خلال 24 ساعة إلى 48 ساعة (أنظر 6 . )4 هلام بسلفيت الحديد 3( . .)1 الحضن تعطي في درجة حرارة 50 °م + 1 °م، تحليل النتائج :

خلال 24 ساعة إلى 48 ساعة (أنظر 6 . )4 نتيجة تعطي عدد البكتيريا المرجعة للسلفيت النامية في الشروط اللاهوائية تحليل النتائج :

نتيجة تعطي عدد البكتيريا المرجعة للسلفيت النامية في الشروط اللاهوائية تجارب الإثبات (أنظر الملاحظة 2 في 6 . )5 حول :

- القدرة التنفسية

- تشكل الأبواغ نتيجة تعطي عدد كلوستريديا.

تجارب الإثبات (أنظر الملاحظة 2 في 6 . )5 حول :

- القدرة التنفسية

- تشكل الأبواغ نتيجة تعطي عدد كلوستريديا المقاومة للحرارة. 8 ذو الحجة عام 1434 ه الجريدة الرّسميّة 13 أكتوبر سنة 2013 م