قرار مؤرخ في 19 رمضان ع ام 1427 الموافق 11 أكتوبر سنة 2006، يجعل منهج معايرة الأفلاتوكسين B1 ومجموعة الأفلاتوكسين B1 و B2 و G1 و G2 في الحبوب والمكسرات والمنتوجات المشتقة إجباريا

م ن أجل معايرة الأفلاتوكسين B1 ومجموعة الأفلاتوكسين B1 و B2 و G1 و G2 في الحب وب والمكسرات والمنتوجات المشتقة، فإن مخابر مراقبة الجودة وقمع الغش وتلك المعتمدة لهذا الغرض ملزمة باستعمال المنهج المبين في الملحق.

كما يجب أن يستعمل هذا المنهج من طرف المخبر عند الأمر بإجراء خبرة.

الم ادة 3 : ينشر هذا القرار في الجريدة الرسمية للجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية.

حرر بالجزائر في 19 رمضان عام 1427 الموافق 11 أكتوبر سنة .2006 الهاشمي جعبوب الملحق منهج معايرة الأفلاتوكسين B1 ومجموعة الأفلاتوكسين B1 و B2 و G1 و G2 في الحبوب والمكسرات والمنتوجات المشتقة

1 . مجال التطبيق :

يطبق هذا المنهج لتحديد كميات الأفلاتوكسين الأكبر من 8 ميكرو غرام / كيلو غرام.

2 . المبدأ :

تستخلص العينة المأخوذة للتجربة بخليط مكون من الماء والميثانول. يرشح مستخلص العينة، يخفف بالماء ثم يوضع في عمود الانجذاب المناعي المحتوي على أجسام مضادة خاصة بالأفلاتوكسين B1 و B2 و G1 و G2 تعزل الأفلاتوكسين، تنقى ثم تركز في العمود وتحرر من الأجسام المضادة بالميثانول. تحدد كمية الأفلاتوكسين عن طريق عملية الكروماتوغرافيا السائلة ذات دقة عالية ( CLHP ) في المرحلة المعكوسة مع الكشف عن طريق الإشعاع وانحراف ما قبل العمود باليود.

3 . الكواشف : 1.3 عموميات :

يجب أن تكون جميع الكواشف ذات نوعية تحليلية معترف بها. 2.3 كلورور الصوديوم. 3.3 اليود على شكل بلورات. 4.3 أفلاتوكسين على شكل بلورات أو غشاء، في كبسولات. 22 الجريدة الرّسميّة للجمهوريّة

- يحفظ المخبر الذي تجرى فيه التحاليل من ضوء النهار بكفاية.

- تحفظ محاليل الأفلاتوكسين بعيدا عن الضوء (تحفظ في الظلام باستعمال ورقة من الألمنيوم أو أدوات زجاجية عنبرية). 5.3 أسيتونيتريل، من نوع الكروماتوغرافيا السائلة ذات دقة عالية . 6.3 ميثانول، ذو نوعية تحليلية. 7.3 ميثانول، للكروماتوغرافيا السائلة ذات دقة عالية. 8.3 تولوان 9.3 مذيب الاستخلاص :

يخلط 7 أحجام من الميثانول ( 6.3 ) مع 3 أحجام من الماء. 10.3 عمود الانجذاب المناعي :

يحتوي عمود الانجذاب المناعي على أجسام مضادة موجهة ضد الأفلاتوكسين B1 و B2 و G1 و G2 يجب أن لا تكون القدرة الدنيا لربط عمود الانجذاب المناعي أصغر من 100 نانو غرام من الأفلاتوكسين B1 وأن لايكون استرجاع الأفلاتوكسين B1 و B2 و G1 أصغر من 80 % ومن 60 % بالنسبة للأفلاتوكسين G2 عند استعمالنا في عمود الانجذاب المناعي، محلول مثبت ل 5 نانوغرام لكل سم في 15 ملل لخليط الميثانول و الماء ( قسم يقدر بحجم من الميثانول ل 1 + 3,4 أحجام من الماء). يجب أن يحتوي عمود الانجذاب المناعي على مخزن لمذيب مناسب، مثلا حقنة مزودة بمكيف. 11.3 المرحلة المتحركة :

يخلط 3 أحجام من الماء مع حجم واحد من أسيتونيتريل ( 5.3 ) و حجم واحد من الميثانول ( 7.3 ) ينزع الغاز من المحلول قبل استعماله. 12.3 كاشف الانحراف ما بعد العمود :

يذوب 100 مغ من اليود ( 3.3 ) في 2 ملل من الميثانول ( 6.3 ) يضاف 200 ملل من الماء. يرج لمدة ساعة ثم يرشح بواسطة مصفاة، نفاذيتها 0,45 ميكرومتر( 8.4 ) يحضر ويستعمل المحلول في نفس الأسبوع ثم يخزن في الظلام في قارورة زجاجية بنية.

يرج لمدة 10 دقائق قبل الاستعمال. 13.3 خليط تولوان / أسيتونتريل :

يخلط 98 قسم بالحجم من تولوان ( 8.3 ) مع قسمين بالحجم من الأسيتونتريل ( 5.3 .) 14.3 محاليل الأم للأفلاتوكسين B1 و B2 و G1 و G2 :

يذوب بصفة منفصلة، الأفلاتوكسين B1 و B2 و G1 و G2 في خليط تولوان / أسيتونتريل ( 13.3 ) للحصول على محاليل منفصلة تحتوي على 10 ميكروغرام / للميليمتر.

من أجل تحديد التركيز الدقيق للأفلاتوكسين في كل محلول أم، يسجل طيف الامتصاص بين طول الموجة تقدر ب 330 نانومتر و 370 نانومتر داخل أنابيب من الكوارتز ل 1 سنتيمتر ( .4 8 ) بواسطة جهاز منظار طيفي. حيث أن الخليط تولوان / أسيتونتريل ( 13.3 ) هو الأنبوب المرجعي.

يحسب التركيز الكتلي لكل أفلاتوكسين pi المعبر عنه ب الميكروغرام للميللتر عن طريق المعادلة (1) التالية :

A القصوى xiMx 100 pi = εi dx حيث :

A القصوى : الامتصاص الأقصى المحدد لطيف الامتصاص.

Mi : هي الكتلة الجزيئية المتعلقة بكل أفلاتوكسين بالغرام لكل مول. εi : الامتصاصية المولارية لكل أفلاتوكسين في الخليط تولوان/ أسيتونتريل ( 13.3 ) بالمتر المربع لكل مول. d : المسافة الضوئية للخلية، بالسنتيمتر.

يعبر عن Mi و εi في الجدول ( 1 ) التالي :

أفلاتوكسين Mi غرام / مول εi متر مربع / مول B1 312 1930 B2 314 2040 G1 328 1660 G2 330 1790 الجدول 1 - الكتلة الجزيئية النسبية والامتصاصية الملارية للأفلاتوكسين B1 و B2 و G1 و G2 (خليط التولوان والأسيتونتريل). 15.3 محلول الأم للأفلاتوكسين المختلط :

يحضر محلول الأم يحتوي على 500 نانوغرام/ لتر من الأفلاتوكسين B1، 125 نانوغرام/ لتر من الأفلاتوكسين B2، 250 نانوغرام/ لتر من الأفلاتوكسين G1 و 125 2 محرّم عام 1428 ه الجريدة الرّسميّة 21 يناير سنة 2007 م نانوغرام/ لتر من الأفلاتوكسين G2 في الخليط تولوان / أسيتونتريل ( 13.3 .) عند تخزين المحلول يتعين وزن الوعاء و تسجل كل التغيرات عند استعمال المحلول.

يغطى الوعاء بعناية ب ورق الأليمنيوم ويخزن في 4 م° تقريبا. 16.3 محاليل التثبيت للأفلاتوكسين المختلط :

تنقل كل كمية محددة في الجدول ( 2 ) لمحلول الأم للأفلاتوكسين المختلط ( 15.3 ) إلى سلسلة مكونة من ثلاث ( 3 ) قنينات مدرجة ب 2 ملل ( 5.4 .) تترك المحاليل تتبخر في محيط جاف تحت تدفق الأزوت في درجة حرارة المحيط. يضاف في كل وعاء 1 ملل من الميثانول، يخلط ثم يخفف بالماء حتى خط الوعاء ثم يخلط من جديد. يحضر المحلول يوم الاستعمال.

مقتطع من التركيز الكتلي ( نانوغرام / ملل ) محلول محلول الأم مثبت (ميكرولتر B1 B2 G1 G2 ( 15.3 ) 1 60 15,0 3,75 7,50 3,75 2 40 10,0 2,50 5,00 2,50 3 20 5,00 1,25 2,50 1,25 4 10 2,50 0,625 1,25 0,625 الجدول 2 - تحضير محاليل التثبيت.

القيم المبينة في هذا الجدول معطاة على سبيل البيان. تغطى مجموعة المرجع تراكيز العينات. 17.3 حمض الس يلفريك، ( SO4 H2 ) C = 2 مول / لتر.

4 . التجهيزات : 1.4 التجهيزات العادية للمخبر :

يجب أن تغمر الأدوات الزجاجية للمخبر التي تلامس المحاليل المائية للأفلاتوكسين في حمض السيلفريك ( 2 مول / لتر ) لعدة ساعات ثم تغسل جيدا بالماء ( مثلا 3 مرات ) لإزالة أي أثر للحمض. التحقق ( )16.3 من عدم وجود الحمض بواسطة ورق .pH

- تعتبر هذه المعالجة ضرورية لأنه يمكن أن يتسبب استعمال الأدوات الزجاجية المغسولة بدون حمض في فقدان الأفلاتوكسين .

عمليا، تعتبر هذه المعالجة ضرورية بالنسبة للأواني الكروية ذات قاع دائري، القنينات المدرجة، مخبار مدرج، القارورات أو الأنابيب لمحاليل التثبيت والمستخلصات النهائية ( لا سيما قنينات آخذات العينات الآلية ) و ماصات باستور عند استعمالها من أجل نقل محاليل التثبيت أو المستخلصات. 2.4 جهاز للسحق، مزود بكأس سعته 500 ملل وغطاء. 3.4 ورق الترشيح ذو طيات، قطره 24 سنتيمتر على سبيل المثال. 4.4 ورق الترشيح مزود بألياف زجاجية دقيقة، قطره 11 سنتيمتر على سبيل المثال. 5.4 قنينات مدرجة، سعتها 2 ملل على سبيل المثال. 6.4 جهاز المنظار الطيفي، بإمكانه أن يغطي موجات طولها يتراوح بين 200 نانومتر و 400 نانومتر. 7.4 أنابيب من الكوارتز، ذات مسافة ضوئية تقدر ب 1 سم غير حساسة لامتصاص الموجات التي يتراوح طولها بين 300 نانومتر و 370 نانومتر. 8.4 مصفاة ذات غ شاء للم حاليل المائية، من متعدد ثلاتي فلور الإيثيلان ( PTFE ) ذات قطر 4 مم و 0,45 ميكرومتر من النفاذية. 9.4 تجهيزات الكروماتوغرافيا السائلة ذات دقة عالية، تتكون من العناصر التالية : 1.9.4 مضخة الكروماتوغرافيا السائلة، مهيئة من أجل تدفق يساوي 1 ملل / الدقيقة. 2.9.4 نظام للحقن، صمام للحقن مجهز بحلقة سعتها 50 ميكرولتر أو نظام مشابه. 3.9.4 عمود تحليلي للفصل في المرحلة المعكوسة، على سبيل المثال، C18 يضمن الحصول على فصل لقمم الأفلاتوكسين B1 و B2 و G1 و G2 انطلاقا من خط القاعدة، تكون هذه القمم متميزة جدا عن القمم الأخرى.

- الطول 250 مم.

- القطر الداخلي 4,6 مم.

- الجزيئات الكروية قطرها 5 ميكرومتر.

يمكن استعمال أعمدة أقصر. 4.9.4 نظام انحراف ما قبل العمود :

يتكون من مضخة ثانية بدون دفع ( غير بيريستالتيكي ) وقطعة على شكل حرف T بدون حجم ميت و من أنبوب متعدد ثلاثي- فلور الإيثيلان PTFE( ) 24 الجريدة الرّسميّة للجمهوريّة أو من الفولاذ غير المؤكسد يتراوح طوله بين 3000 ميليمتر و 5000 ميليمتر وقطره الداخلي 0,5 مم وكذا حمام التسخين أو وسيط ما قبل العمود من أجل تفاعل اليود. 10.4 كاشف الإشعاع :

مع موجة تحريض معدلة في 365 نانومتر وموجة إرسال طولها 435 نانومتر( بالنسبة لوسائل الترشيح طول موجة الإرسال < من 400 نانومتر). من الممكن كشف 0,05 ملغ من الأفلاتوكسين B1 على الأقل لحجم محقون ( أي 50 ميكرولتر). .5 طريقة العمل : 1.5 الاستخلاص :

يوزن بتقريب 10 ملغ، 25 غ من العينة المأخوذة للتجربة نقوم بعملية المجانسة في جهاز للسحق، يضاف 5 غ من كلورور الصوديوم ( 2.3 ) و 125 ملل من مذوب الاستخلاص ( 9.3 )، ثم نقوم بعملية المجانسة بواسطة خلاط لمدة دقيقتين بسرعة كبيرة .

- ينبغي التحقق من أن سرعة الخلط لا تنقص من فعالية الاستخلاص.

يرشح بواسطة ورق الترشيح المطوي ( 3.4 .) يدخل بواسطة ماصة 15 ملل (ح 2 ) من الرشاحة داخل قنينة مخروطية الشكل ذات أبعاد مناسبة. يضاف 30 ملل من الماء، تسد القنينة وتخلط قبل البدء في عملية الكروماتوغرافيا في عمود الانجذاب المناعي، يرشح المستخلص المخفف على ورق الترشيح، يحتوي على ثقوب صغيرة جدا من الزجاج ( 4.4 ) يتعين أن تكون الرشاحة (ح 3 ) صافية، في حالة العكس، يعاد الترشيح من جديد. ونقوم بالمعالجة مباشرة حسب ( 2.5 .) 2.5 التنقية :

يحضر عمود الانجذاب المناعي ثم تجرى عملية التنقية بواسطة ماصة، توضع 15 ملل (ح 4 ) من الرشاحة الثانية (ح 3 ) في خزان المذوب للعمود .)10.3( يجمع ناتج الميثانول أو أسيتونيتريل ( حسب المنتوج ) في قنينة مدرجة ل 2 ملل ( 5.4 .) يخفف حتى الخط بالماء (ح 5 .) يخلط ثم تجرى العملية وفقا ل ( 3.5 .) من أجل تحليلها عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة ذات الدقة العالية، يجب أن تحتوي محاليل العينات ومحاليل التثبيت على نفس المذوب أو نفس خليط المذوبات.

- إن مناهج التوضع في أعمدة الانجذاب المناعي وعملية غسل العمود والناتج تختلف قليلا من صانع العمود إلى آخر، يتعين اتباع التعليمات الخاصة المسلمة مع الأعمدة بدقة.

يراعى عدم تجاوز القدرة القصوى للعمود. 3.5 شروط استعمال الكروماتوغرافيا السائلة ذات الدقة العالية :

تربط الفتحة الخارجية لعمود الفصل بإحدى القطع على شكل T ( 4.9.4 ) بواسطة قطعة صغيرة من أنبوب قطره الداخلي 0,25 مم مثلا. تربط بالجزء الثاني من T الفتحة الخارجية للمضخة الثانية بدون دفع التي توزع الكاشف من أجل الانحراف ما قبل العمود. يربط أحد أطراف الأنبوب الحلزوني من متعدد ثلاثي فلور الإيثيلان ( PTFE ) أومن الفولاذ غير المؤكسد ( 4.9.4 ) بالجزء الثالث للقطعة T والطرف الآخر بالكاشف. يثبت الأنبوب الحلزوني بواسطة مجفف أو حمام مائي في درجة حرارة التفاعل تقدر ب 70 °م.

اعتبرت التعديلات التالية مناسبة عند استعمال العمود المحدد في ( 3.9.4 ) :

- التدفق في مرحلة الحركة (العمود) 1,0 ملل / الدقيقة.

- تدفق الكاشف ما قبل العمود 0,3 ملل / الدقيقة.

- الحجم المحقون: 50 ميكرو لتر.

يترك النظام يشتغل لمدة 10 دقائق لتثبيته. في حالة استعمال جهاز مكامل، تعدل حساسية كاشف الإشعاع أو الجهازالمكامل من أجل الحصول على نسبة تأشير/ الصوت ل 5/1 ل 0,125 نانوغرام من الأفلاتوكسين G2 في 50 ميكرو لتر.

في حالة استعمال مسجل على ورق، يعدل مقبض كاشف الإشعاع للحصول على سلم للتنقل من 30 % إلى 40 % مع 0,125 نانوغرام من الأفلاتوكسين G2 في 50 ميكرولتر. تمرر الرشاحة الثانية (ح ) في 3 العمود، تغسل هذه الأخيرة طبقا لتعليمات الصانع وتحذف النواتج. 4.5 التعرف :

التعرف على كل قمة الأفلاتوكسين للكروماتوغرام الناتجة عن تحليل العينة المأخوذة للتجربة بمقارنة أزمنة الاسترجاع مع المعايير المرجعية الموافقة . 5.5 منحنى المعايرة :

يحضر منحنى المعايرة لكل أفلاتوكسين بحقن 50 ميكرولتر من المحاليل المثبتة 1، 2، 3 و 4 ( جدول 2 .) 2 محرّم عام 1428 ه الجريدة الرّسميّة 21 يناير سنة 2007 م 6.5 المعايرة :

يتم التحديد الكمي حسب منهج المعايرة الخارجية بتكامل سطح القمة أو قياس ارتفاع القمة الذي يتم مقارنته بعد ذلك مع القمة الموافقة لمحلول مرجعي.

يحقن بحجم يقدر ب 50 ميكرو لتر خليط المعايرة في الحلقة مع إتباع تعليمات صانع جهاز الحقن. يتم ظهور الأفلاتوكسين بالترتيب G2 و G1 و B2 و B1 مع أزمن ة الحجز على التوالي بحوالي 6 دق ائق، 8 دقائق، 9 دقائق و 11 دقيقة و يتعين أن تكون القمم منفصلة تماما. إذا اقتضى الأمر يعدل زمن الحجز بتغيير تركيز الميثانول في المذوب لمرحلة الحركة ( 11.3 .) يحقن 50 ميكرولتر ( ح 6 ) من مستخلص العينة المنقاة ( 2.5 ) في حلقة الحقن.

6 . حساب النتائج :

تحسب كتلة العينة المأخوذة للتجربة ك t بالغرام، الموجودة في قطعة الرشاحة الثانية المقتطعة لعمود الانجذاب المناعي ( ح 4 ) عن طريق المعادلة ( 2 ) التالية :

ح X ح = 2 4 ك t = ك 0 ح X ح 1 3 حيث :

ك : كتلة العينة المأخوذة للتجربة ( 1.5 ) بالغرام 0 ( ك 0 = 25 غ )، ح : الح جم الكلي للرش احة ( 1.5 ) بالميليل تر 1 ( ح 1 = 125 ملل )، ح : حجم قطعة الرشاحة الأولى ( 1.5 ) بالميليلتر 2 ( ح 2 = 15 ملل )، ح : الحجم الكلي للرشاحة الثانية ( 1.5 ) 3 بالميليلتر ( ح 3 = 45 ملل )، ح : حجم قطعة الرشاحة الثانية ( 2.5 ) بالميليلتر 4 ( ح 4 = 15 ملل .) تحسب القطعة الكتلية لكل أفلاتوكسين، WI، بالميكروغرام / كيلوغرام للعينة عن طريق المعادلة ( 3 ) التالية ( منهج المعايرة الخارجية ) :

ح X ك 5 i W1 = ح X ك 6 t حيث :

ح = الحجم الناتج ( 2.5 ) بالميكرولتر ( ح 5 = 2000 5 ميكرولتر )، ح = ح جم ال ناتج المح قون ( 6.5 ) بالم يكرولتر 6 ( ح 5 = 50 ميكرولتر )، ك = هي الكتلة، بالنانوغرام لكل أفلاتوكسين i الموجودة في الحجم المحقون، الموافقة للمساحة أو الارتفاع المقاس للقمم المأخوذة من منحنى المعايرة، ك = كتلة العينة المأخوذة للتجربة بالغرام t الموجودة داخل قطعة الرشاحة الثانية المقتطعة لعمود الانجذاب المناعي ( ح ) (حسب المعادلة 2 .) 4 تضاف القطع الكتلية للأفلاتوكسينات الأربعة للحصول على القطعة الكتلية لمجموع الأفلاتوكسينات .

7 . التكرارية :

يجب أن لا يتجاوز الفرق المطلق بين نتيجتين وحيدتين للتجربة على نفس المادة ا لمجربة، المتحصل عليه من طرف المخبري استعمل نفس التجهيزات، في أقصر مجال زمني ممكن، حدود التكرارية (ت) في أكثر من 5 % من الحالات.

8 . التكرارية بين عدة مخابر:

يجب أن لا يتجاوز الفرق المطلق بين نتيجتين وحيدتين للتجربة على نفس المادة المجربة بين مخبرين، حدود التكرارية (ت) في أكثر من 5 % من الحالات المتحصل عليها.

وزارة الثقافة