قرار مؤرّخ في 19 جمادى الثانية عام 1447 الموافق 10 ديسمبر سنة 2025، يجعل منهج المعايرة الإنزيمية للسكروز في عصائر الفواكه والخضر بتقنية قياس الطيف بنيكوتيناميد أدينين دينوكليوتيد فوسفات )NADP(، إجباريا

تطبيقا لأحكام المادة 19 من المرسوم التنفيذي رقم 90-39 المؤرّخ في 3 رجب عام 1410 الموافق 30 يناير سنة 1990 والمذكور أعلاه، يهدف هذا القرار إلى جعل منهج المعايرة الإنزيمية للسكروز في عصائر الفواكه والخضر بتقنية قياس الطيف بنيكوتيناميد أدينين دينوكليوتيد فوسفات )NADP(، إجباريا.

من أجل المعايرة الإنزيمية للسكروز في عصائر الفواكه والخضر بتقنية قياس الطيف بنيكوتيناميد أدينين دينوكليوتيد فوسفات )NADP(، تلزم مخابر قمع الغش والمخابر المعتمدة لهذا الغرض باستعمال المنهج المحدد في الملحق المرفق بهذا القرار.

يجب أن يستعمل هذا المنهج من طرف المخبر عند الأمر بإجراء خبرة.

ينشر هذا القرار في الجريدة الرّسميّة للجمهوريّة الجزائريّة الدّيمقراطيّة الشّعبيّة.

حرّر بالجزائر في 19 جمادى الثانية عام 1447 الموافق 10 ديسمبر سنة 2025 .

أمال عبد اللطيف ––––––––––––– الملحق منهج المعايرة الإنزيمية للسكروز في عصائر الفواكه والخضر

- تقنية قياس الطيف بنيكوتيناميد أدينين دينوكليوتيد فوسفات - .1 مجال التطبيق :

يحدد هذا المنهج تقنية التحليل الإنزيمي بهدف تحديد نسبة السكروز في عصائر الفواكه والخضر ومنتجاتها المشتقة. .2 الرموز والاختصارات :

لاحتياجات هذا المنهج، تطبق الرموز والاختصارات الآتية :

- ATP : أدينوسين - -'5 ثلاثي فوسفات،

- ADP : أدينوسين- -'5 ثنائي الفوسفات،

- :NADP β - نيكوتيناميد- أدينين -دينوكليوتيد- فوسفات،

- NADPH : β -نيكوتيناميد-أدينين-دينوكليوتيد- فوسفات مختزل،

- -P 6 G- : غلوكوز– 6 – فوسفات،

- HK : هيكسوكيناز،

- G6P-DH : غلوكوز- 6 – فوسفات منزوعة الهيدروجين،

- BF β: - فركتوزيداز، UI : وحدة دولية (ود)، والتي توافق كمية الإنزيم التي تحفز تفاعل 1 ميكرومول من الركيزة في الدقيقة عند 25 ° م.

C : التركيز المولي، :ρ التركيز الكتلي. .3 المبدأ والتفاعلات : 1.3 المبدأ يتحلل السكروز مائيًا (مقلوبا) بطريقة إنزيمية بفعل BF في عينة التجربة مخففة للحصول على كميات متساوية من -D غلوكوز و -D فركتوز. ثم يتم بعد ذلك فسفرة D - غلوكوز المتكوّن في الموضع 6 C- خلال التفاعل الإنزيمي المحفز المتضمن ATP و HK .

وفي تفاعل متزامن، يتم تحوّل -P 6 G- بشكل متكافئ إلى

6 - فوسفوغلوكونات في وجود NADP، ويتم تحفيز التفاعل بواسطة إنزيم G6P-DH، وتتكون كمية من NADPH تكافئ كمية -D غلوكوز الموجود في عينة التجربة )2.3( .

يتم التحديد الكمّي ل NADPH المتكوّن، و بالتالي تتم معايرة D - غلوكوز والسكروز المنجزة عن طريق قياس الطيف.

في العصائر التي تحتوي على القليل من السكروز (أقل من 5 غ/لتر) والمزيد من الغلوكوز، يستحيل الحصول على التحديد الكمّي الدقيق للسكروز عن طريق المعايرة الإنزيمية التقليدية. في هذه الحالة، يجب التخلص من الغلوكوز عن طريق التفاعل مع اليود عند عامل هيدروجيني )pH( قاعدي قبل تحديد كمية السكروز. 2.3 التفاعلات سكروز + O H BF D غلوكوز -D+ فركتوز (1) 2 غلوكوز + ATP HK ADP+G6P (2) NADP+G6P DH-G6P 6 - فوسفوغلوكونات+ NADP + H+ (3) .4 الكواشف :

تستعمل فقط الكواشف ذات النوعية التحليلية المعترف بها والماء من النوعية 3 على الأقل. 1.4 محاليل هيدروكسيد الصوديوم يتم تحضير محاليل هيدروكسيد الصوديوم بتراكيز )NaOH( C = 5 مول/لتر و )NaOH( C = 4 مول/ لتر و(HOaN) C = 2 مول/لتر. 2.4 محلول مثبّت من السيترات pH = 4٫6 يذاب 6,9 غ من حمض الستريك أحادي الهيدرات O( ,H2 O7 H8 C6 ) و 9,1 غ من سيترات ثلاثي الصوديوم ثنائي الهيدرات )C6H5Na3O7,2H2O( في 150 ملل من الماء، يضبط في pH = 4٫6 بمحلول هيدروكسيد الصوديوم c)NaOH(( = 2 مول/ لتر) ( 1.4 ) ويكمل الحجم بالماء إلى 200 ملل. يحفظ المحلول المثبت لمدة سنة واحدة، على الأقل، في + 4 °م. 4 3. محلول BF يذاب 10 ملغ من -β فركتوسيداز، ρ = 5 ملغ/ ملل، حوالي 750 ود/ ملل في 2 ملل من المحلول المثبت للسيترات ( 2.4 .) يحفظ المحلول المثبت لمدة أسبوع واحد، على الأقل، عند 4+ °م. 4.4 محلول مثبت لثلاثي إيثانولامين، pH = 7٫6 يذاب 14 غ من كلورهيدرات ثلاثي إيثانولامين و 0,25 غ من كبريتات المغنيسيوم سباعي التمييه ,7H2O( )MgSO4 في 80 ملل من الماء، يضبط العامل الهيدروجيني pH = 7٫6 بحوالي 5 ملل من محلول هيدروكسيد الصوديوم )NaOH(( C = 5 مول/ لتر ) ويكمل الحجم بالماء إلى 100 ملل.

يحفظ المحلول المثبت لمدة أربعة (4) أسابيع، على الأقل، عند + 4 °م. 5.4 محلول NADP يذاب 60 ملغ من ملح ثنائي الصوديوم ل β -نيكوتيناميد- أدينين-دينوكليوتيد-فوسفات -NADP-Na2( )β في 6 ملل من الماء. يحفظ هذا المحلول لمدة أربعة (4) أسابيع، على الأقل، عند + 4 °م. 6.4 محلول ATP يذاب 300 ملغ من ملح ثنائي الصوديوم ل أدينوسين - -'5 ثلاثي فوسفات )ATP-Na2H2.3H2O( و 300 ملغ من هيدروجينوكربونات الصوديوم )NaHCO3( في 6 ملل من الماء. يحفظ هذا المحلول لمدة أربعة (4) أسابيع، على الأقل، عند + 4 °م. 7.4 معلّق إنزيمات DH - G6P / HK يوضع في معلّق الهكسوكيناز، ρ)HK( 2= ملغ/ ملل، حوالي 280 ود/ ملل D( - غلوكوز المستخدم كركيزة في وجود ATP ) و G6P-DH، )G6P-DH( ρ = 1 ملغ/ ملل، حوالي 140 ود/ ملل (مع -P 6 G- كركيزة) في محلول كبريتات الأمونيوم، c))NH4(2SO4( = 3,2 مول/ ل. يحفظ هذا المعلّق لمدة سنة واحدة، على الأقل، عند + 4 °م. 8.4 محلول اليود يذاب، في حوجلة مدرّجة سعتها 1 لتر، 130 غ من اليود و 150 غ من يوديد البوتاسيوم في كمية كافية من الماء بعد الإذابة، يكمل بالماء حتى خط التدريجة. 9.4 حمض الكبريتيك يحضر محلول حمض الكبريتيك بتركيز c)H2SO4( = 0,5 مول/ لتر انطلاقا من محلول معاير مُركَّز مناسب. 26 الجريدة الرسميّة للجمهوريّة 10.4 محلول كبريتيت الصوديوم يحضر محلول مشبع من كبريتيت الصوديوم في الماء (القابلية للذوبان ρ)NA2SO3( = 12,54 غ / 100 ملل عند 0 °م و 28,3 غ / 100 ملل عند 80 °م).

يحضر محلول مخفف بإضافة تسعة (9) أحجام من الماء إلى حجم واحد من المحلول المركز. 11.4 محلول الفينول فثالين يحضر محلول من الفينول فثالين ( ρ = 0,5 غ/ 100 ملل) في الإيثانول. .5 الأجهزة :

الأجهزة المتداولة في المخبر، على الخصوص، الأجهزة الآتية : 1.5 ماصات للتحليل الإنزيمي، مدرّجة فقط على طول الأنبوب، مع طرف تدفق طويل غير مدرّج. 2.5 ماصات، ذات دقة مكافئة لتلك الموجودة في 1.5 بديل ل ( 1.5 )، مثل الماصات الرفيعة ذات الإزاحة الموجبة. 3.5 خلايا من الكوارتز أو الزجاج أو البلاستيك، ذات مسار بصري 10 ملم، بدون امتصاص ملحوظ عند الأطوال الموجية المعتبرة (على سبيل المثال 334 نانومتر أو 340 نانومتر أو 365 نانومتر). 4.5 مطياف بمرشحات، مع مصباح بخار زئبقي، للقياسات عند الأطوال الموجية 334 نانومتر أو 365 نانومتر. 5.5 مطياف، (طول الموجة متغير) للقياسات عند طول موجة 340 نانومتر (بديل ل 4.5 .) .6 طريقة العمل : 1.6 تحضير عيّنة التجربة 1.1.6 التحضير العادي للعيّنات يجب تخفيف عصير الفواكه بحيث تتراوح نسبة السكروز والغلوكوز بين 0,1 غ/لتر و 1,5 غ/لتر. بشكل عام، يستوجب ألاّ تعالج المنتوجات معالجة مسبقة، غير أن التخفيف قد يكون ضروريا،ً ويجب أن يكون تحليلها بهذا المنهج على أساس الحجم، مع التعبير عن النتائج لكل لتر من العينة. يمكن أن يتم أيضا تحليل المنتوجات المركزة على أساس الحجم بعد التخفيف إلى كثافة نسبية معروفة.

في هذه الحالة، يجب الإشارة إلى الكثافة المعنية. بما أنّ العينة موزونة مع مراعاة عامل التخفيف في التحليل، يمكن أيضا التعبير عن النتائج لكل كيلوغرام من المنتوج.

بالنسبة للمنتوجات شديدة اللزوجة و/أو التي تحتوي على نسبة عالية من الخلايا (مثل اللب)، فإن طريقة العمل المعتادة هي القيام بالتحديد على أساس كتلة عينة التجربة.

تخلط العيّنات العكرة جيدًا قبل التخفيف، قد يكون من الضروري تخفيف هذه العينات العكرة، وكذا العينات الملوّنة كثيرا، أكثر ممّا تتطلبه نسبة السكروز. تصفى مسبقا العينات العكرة التي تحتوي على تراكيز ضعيفة جداً من السكروز عن طريق الطرد المركزي أو الترشيح على غشاء من خلال مرشح 0,2 ميكرومتر. 2.1.6 تحضير معدّل للعينات لتحديد كمية السكروز في وجود تركيز عالٍ من الغلوكوز يخفف عصير الفاكهة (المصفى بالترشيح أو بالطرد المركزي، كما هو موضح في ( 1.1.6 ) إلى الخُمس. في حوجلة مدرّجة سعتها 50 ملل، يضاف إلى 10 ملل من عصير الفاكهة المخفف/ المصفى 10 ملل من محلول اليود ( 8.4 ) و 2,5 ملل من محلول هيدروكسيد الصوديوم ب 4 مول/لتر ( 1.4 ) [يجب إضافة المحاليل بهذا الترتيب]. تترك الحوجلة في الظلام لمدة عشر ( 10 ) دقائق. يضاف 10 ملل من محلول حمض الكبريتيك ( 9.4 ) إلى هذا المحلول.

يُتخلّص من اليود الزائد بإضافة الكميات اللاّزمة من محاليل كبريتيت الصوديوم المشبّع والمخفف ( 10.4 ) ويرجّ حتى اختفاء اللّون الأصفر/ البني.

يضبط العامل الهيدروجيني للمحلول إلى حوالي =8 pH أو 9 عن طريق المعايرة بمحلول هيدروكسيد الصوديوم ب 4 مول/لتر ( 1.4 ) بواسطة محلول كاشف الفينول فثالين ( 11.4 ) حتى ثبات اللّون الوردي الفاتح. يجب إكمال هذا المحلول حتى 50 ملل ثم يستعمل لمعايرة السكروز. 2.6 التحليل 1.2.6 عموميات يجب إنجاز المعايرة عند درجة حرارة ثابتة تتراوح بين 20 °م و 25 °م، أو عند درجة حرارة ثابتة تقل أو تساوي 37 °م، شريطة أن تكون النتائج المتحصل عليها متكافئة.

يقع الحد الأقصى لامتصاص NADPH عند طول موجة 340 نانومتر. في حالة استعمال مطياف متغير الطول الموجي، لا تجرى القياسات إلا عند امتصاص أقصى ل NADPH . في حالة استعمال مطياف برشاحات مزود بمصباح بخار الزئبق، تجرى القياسات في طول موجة 334 نانومتر أو في 365 نانومتر.

لا تستعمل ماصات التدفق الكلّي (تدريجة واحدة) للعيّنات المشار إليها أدناه. يمكن أيضا أخذ عينات من محاليل الإنزيمات والإنزيمات المساعدة والمحاليل المثبتة بماصات آلية. بالنسبة لمحاليل العينات، تستخدم الماصات للتحليل الإنزيمي ( 1.5 ) أو ما يعادلها )2.5( .

يمكن أيضا إجراء المعايرة بتشكيلة من الكواشف الجاهزة للاستعمال المتوفرة في السوق.

يوصى باستعمال السكروز كمحلول معاير في هذه المعايرة. 2.2.6 المحلول الشاهد لمعايرة السكروز يُدخَلُ في الخلايا بواسطة ماصة، 0,20 ملل من محلول مثبت للسيترات ( 2.4 ) و 0,02 ملل من محلول BF ( 3.4 .) يخلط، ثم بعد خمس عشرة ( 15 ) دقيقة، يضاف 1 ملل من محلول مثبت من ثلاثي الإيثانولامين ( 4.4 ) و 1,70 ملل من الماء و 0,1 ملل من محلول NADP ( 5.4 ) و 0,1 ملل من محلول ATP )6.4( .

يخلط وبعد ثلاث (3) دقائق، يقرأ الامتصاص )A1( للمحلول بالنسبة إلى الهواء ( بدون خلية في المسار البصري). 3.2.6 محلول شاهد لمعايرة الغلوكوز يُدخَلُ في الخلايا بواسطة ماصة 1 ملل من المحلول المثبت ( 4.4 ) و 1,92 ملل من الماء و 0,1 ملل من محلول NADP ( 5.4 ) و 0,1 ملل من محلول ATP ( 6.4 .) يخلط وبعد ثلاث (3) دقائق، يقرأ الامتصاص )A2( للمحلول بالنسبة إلى الهواء (بدون خلية في المسار البصري). 4.2.6 محلول العينة لمعايرة السكروز يدخل في الخلايا بواسطة ماصة 0,20 ملل من محلول مثبت للسيترات ( 2.4 ) و 0,10 ملل من محلول العينة و 0,02 ملل من محلول BF ( 3.4 .) يخلط ويحفظ لمدة خمس عشرة ( 15 ) دقيقة. يضاف بعد ذلك 1 ملل من المحلول المثبت ( 4.4 ) و 1,60 ملل من الماء و 0,1 ملل من محلول NADP ( 5.4 ) و 0,1 ملل من محلول ATP ( 6.4 .) يخلط، وبعد ثلاث (3) دقائق، يقرأ الامتصاص )A3( للمحاليل بالنسبة إلى الهواء (بدون خلية في المسار البصري). 5.2.6 محلول العيّنة لمعايرة الغلوكوز يُدخَلُ في الخلايا بواسطة ماصة 0,10 ملل من محلول العينة و 1 ملل من المحلول المثبت ( 4.4 ) و 1,82 ملل من الماء و 0,1 ملل من محلول NADP ( 5.4 ) و 0,1 ملل من محلول ATP ( 6.4 .) يخلط وبعد ثلاث (3) دقائق، يقرأ الامتصاص )A4( للمحلول بالنسبة إلى الهواء (بدون خلية في المسار البصري). 6.2.6 طريقة عمل أخرى لمعايرة السكروز بعد التخلص من الغلوكوز الحر يحضر شاهد لمعايرة السكروز كما هو موضّح في ( 2.2.6 ) ومحلول عيّنة على النحو الآتي :

يُدخَلُ في الخلايا بواسطة ماصة 0,20 ملل من محلول مثبت للسيترات ( 2.4 ) و 0,10 ملل من محلول العينة المعالج ( 2.1.6 ) و 0,02 ملل من محلول BF ( 3.4 .) يُخلط ويُحفظ لمدة خمس عشرة ( 15 ) دقيقة. يُضاف بعد ذلك 1 ملل من المحلول المثبت ( 4.4 ) و 1,60 ملل من الماء و 0,1 ملل من محلول NADP ( 5.4 ) و 0,1 ملل من محلول ATP ( 6.4 .) يخلط، وبعد ثلاث (3) دقائق، يقرأ الامتصاص )A9( للمحاليل بالنسبة إلى الهواء (بدون خلية في المسار البصري). 7.2.6 التفاعل الإنزيمي، تحديد كمية السكروز تطبق طريقة العمل الآتية لكل محلول ( 2.2.6 ) و ( 3.2.6 ) و( 4.2.6 ) و( 5.2.6 ) و( 6.2.6 ) على حده.

يُضاف 0,02 ملل من معلّق الإنزيمات HK/G6P-DH ( 7.4 .) يخلط جيدًا، ويُنتظر توقف التفاعل عشر ( 10 ) إلى خمس عشرة ( 15 ) دقيقة، وتقرأ امتصاصات المحاليل ( A5 ل ( 2.2.6 ) و A6 ل ( 3.2.6 ) و A7 ل ( 4.2.6 ) و A8 ل ( 5.2.6 ) و A10 ل )6.2.6(( .

يراقب اكتمال التفاعل بتكرار قياسات الامتصاص النهائي بفاصل دقيقتين(2) وذلك لمدة خمس عشرة ( 15 ) دقيقة. إذا لم يكتمل التفاعل في هذا الأجل واستمر في الزيادة بصفة ثابتة، يستقرأ الامتصاص إلى وقت إضافة معلّق الإنزيمات HK/G6P-DH ( 7.4 .) ملاحظة : تَأخذ هذه العملية بعين الاعتبار التفاعلات الثانوية المعروفة جيدا كتفاعلات جانبية وهي معروضة بمزيد من التفصيل في الملحق أ. .7 التعبير عن النتائج :

حسب التفاعلات المتدخلة في هذه المعايرة، فإن كمية NADPH المتكوّنة (وبالتالي الفرق في الامتصاص A ∆ ) تتناسب مع نسبة السكروز الموجود. ....................................................................(4) الغلوكوز ΔA _ الغلوكوز الكلي A Δ = السكروز ∆A ............(5) شاهد السكروز ( 1 A – 5 )A – عينة السكروز ( 3 A – 8 )A = الغلوكوزالكلي ΔA ......................(6) شاهد الغلوكوز ( 2 A – 6 )A – عينة الغلوكوز ( 4 A – 7 )A = الغلوكوز ∆A إذا تم التخلص من الغلوكوز بتفاعل مسبق مع اليود، يتم تبسيط الحساب، وتصبح :

(7) ............ شاهد السكروز ( 1 A – 5 )A – عينة السكروز ( 9 A – 10 )A = السكروز A ∆A 28 الجريدة الرسميّة للجمهوريّة يعتمد حساب نسبة السكروز في المحلول المخفف انطلاقا من قياسات الامتصاص الضوئي على قانون بير- لامبرت.

يتم حساب نسبة السكروز، ρ، ويعبر عنها بالغرام لكل لتر، حسب المعادلة الآتية :

F × V1 × M السكروز ΔA = ρ 1000 × ×V2 ∈ × δ حيث :

M : هي الكتلة الجزيئية للسكروز ( 342,3 غ/ مول)، V1 : هو الحجم الكلي للمحلول في الخلية، بالمليلتر، V2 : هو حجم محلول عينة التجربة المضاف إلى الخلية بالمليلتر، F : هو عامل التخفيف لمحلول العينة ( 1.1.6 أو 2.1.6 )، δ : هو المسار البصري للخلية، بالسنتيمتر، ∈ : هو معامل اختفاء NADPH :

– عند 340 نانومتر = 6,3 ل مليمول- 1 سم- 1،

– عند 365 نانومتر = 3,5 ل مليمول- 1 سم- 1،

– عند 334 نانومتر = 6,18 ل مليمول- 1 سم - .1 سكروز ΔA ∶ هو الفرق في الامتصاص.

إذا لم يتم تعديل مخطط العمل ( 2.2.6 و 3.2.6 و 4.2.6 و 5.2.6 و 6.2.6 )، يتم حساب نسبة السكروز، بالغرام لكل لتر، حسب المعادلة الآتية :

السكروز ΔA × F × 10,34 = ρ ∈ يعبّر عن نسبة السكروز بالغرام لكل لتر وبرقم واحد بعد الفاصلة.

يُؤخذ بعين الاعتبار عامل التخفيف وطريقة التعبير بالنسبة للكتلة أو الحجم. إذا خُفِّف المنتوج المُركَّز حتى تركيزه الأولي، تؤخذ الكثافة النسبية للعينة بالتركيز الأولي كقيمة. .8 الموثوقية : 1.8 التكرارية يجب ألا يتجاوز الفرق المطلق بين نتيجتي تجربتين فرديتين متحصل عليهما على نفس المادة الخاضعة للتجربة، ومن طرف التقني نفسه باستعمال الأجهزة نفسها وفي فترة زمنية قصيرة، قيمة التكرارية r في أكثر من %5 من الحالات.

بالنسبة للتحضير العادي للعينات ( 1.1.6 )، تكون القيم كالآتي :

عصير التفاح r = 1,9 غ/ لتر، نكتار الكشمش الأسود r = 3,2 غ/ لتر، نكتار المشمش r = 3,9 غ / لتر.

بالنسبة للتحضير المعدل للعينات ( 2.1.6 )، تكون القيمة كالآتي: r = 0,4 غ / لتر. 2.8 إعادة التجربة يجب ألاّ يتجاوز الفرق المطلق بين نتيجتي تجربتين فرديتين تم الحصول عليهما على المادة نفسها الخاضعة للتجربة في مخبرين قيمة إعادة التجربة R في أكثر من %5 من الحالات.

بالنسبة للتحضير العادي للعينات ( 1.1.6 )، تكون القيم كما يأتي :

- عصير التفاح R = 3,2 غ/ لتر،

- نكتار الكشمش الأسود R = 5,6 غ/ لتر،

- نكتار المشمش R = 6,9 غ/ لتر.

بالنسبة للتحضير المعدل للعينات ( 2.1.6 )، تكون القيمة كما يأتي :

R = 0,9 غ / لتر.

الملحق أ كيف تعالج التفاعلات الجانبية تنتج التفاعلات الجانبية عمومًا عن تفاعلات ثانوية للإنزيم، بوجود إنزيمات أخرى في مصفوفة العينة، أو إلى تفاعل عنصر أو أكثر من عناصر المصفوفة مع كاشف التفاعل الإنزيمي.

في التفاعل العادي، يصل الامتصاص إلى قيمة ثابتة بعد زمن معين، عادةً بين عشر( 10 ) وعشرين( 20 ) دقيقة، حسب سرعة التفاعل الإنزيمي المخصص. ومع ذلك، عند حدوث تفاعلات ثانوية، لا يصل الامتصاص إلى قيمة ثابتة، بل تزداد بانتظام بمرور الوقت، يسمّى هذا النوع من العمليات عادةً “ التفاعل الجانبي“.

إذا ظهر هذا المشكل، يتوجب قياس امتصاص المحلول على فترات منتظمة (من دقيقتين (2) إلى خمس (5) دقائق) بعد الوقت المطلوب لوصول المحلول المعياري إلى امتصاصه النهائي.

عندما يزداد الامتصاص بمعدل ثابت ( dT/dA = ثابت)، تجرى خمسة(5) أو ستة (6) قياسات، ثم يتم الاستقراء بيانيًا أو عن طريق الحساب للحصول على الامتصاص الذي سيكون للمحلول وقت إضافة الإنزيم النهائي )To( . يُستعمل فرق الامتصاص المستقرأ عند هذه اللحظة Ai( - )Af لحساب تركيز المادة. ––––––––––H–––––––––––