قرار مؤرخ في 13 ذي الحجة عام 1425 الموافق 23 يناير سنة 2005، الحليب ومنتجات الحليب إجباريا

تطبيقا لأحكام المادة 19 من المرسوم التنفيذي رقم 90-39 المؤرخ في 3 رجب عام 1410 الموافق 30 يناير سنة 1990، المعدل والمتمم والمذكور أعلاه، يهدف هذا القرار إلى جعل منهج البحث عن السالمونيلا في الحليب ومنتجات الحليب إجباريا.

من أجل البحث عن السالمونيلا في الحليب ومنتجات الحليب، فإن مخابر مراقبة الجودة وقمع الغش والمخابر المعتمدة لهذا الغرض ملزمة باستعمال منهج التحليل الميكروبيولوجي المبين في الملحق. كما يجب أن يستعمل المخبر هذا المنهج عند الأمر بإجراء خبرة.

ينشر هذا القرار في الجريدة الرسمية للجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية حرر بالجزائر، في 13 ذي الحجة عام 1425 الموافق 23 يناير سنة 2005.

نور الدين بوكروح 15 يونيو سنة 2005 م الملحق منهج البحث عن السالمونيلا في الحليب و منتجات الحليب

1- تعاريف ضمن إطار هذه الطريقة تطبق التعاريف التالية: 1.1 السالمونيلا :

عضو مجهري دقيق، يشكل مستعمرات نموذجية فوق أوساط انتقائية، صلبة لها مميزات بيوكميائية ومصلية مبينة عند إجراء التجارب وفق هذه الطريقة. 2.1 البحث عن السالمونيلا :

يتم الكشف عن وجود أو غياب هذه الأعضاء المجهرية الدقيقة في كتلة أو حجم محدد في المنتوج، عند إجراء التجربة وفق هذه الطريقة.

2 - المبدأ :

على العموم ، البحث عن السالمونيلا يتطلب أربعة مراحل متتالية كما هو مبين في 1.2 إلى 4.2 (لاحظ كذلك كيفية العمل المبينة في الملحق) 1.2 الاغتناء المسبق في وسط سائل :

تزرع العينة المأخوذة للتجربة داخل الوسط، ثم تحضن في37°م لمدة 16 إلى 20 ساعة. 2.2 الاغتناء في أوساط سائلة انتقائية :

يزرع وسط لرباعي التيونات و وسط سيلينيت السيستين مع الزرع المتحصل عليه في ( 1.2).

يحضن الوسط لرباعي التيونات في 43 م و يحضن وسط السيلينيت السيستين في 37°م على مرحلتين من 18 إلى 24 ساعة. 3.2 العزل والتعريف :

انطلاقا من الزرع المتحصل عليه (2.2)، يزرع الوسطين الانتقائيين الصلبين من هلام الأحمر الفينول و الأخضر اللامع و هلام السلفيت البسميث.

يحضنان في 37° م ثم يختبران بعد 20 إلى 24 ساعة وإن اقتضى الأمر، يختبران بعد 40 إلى 48 ساعة، من أجل مراقبة وجود مستعمرات، المفترض أنها السالمونيلا بسبب خصائصها. 4.2 الإثبات :

يعاد زرع المستعمرات ، المفترض أنها السالمونيلا (3.2) والتأكد بواسطة اختبارات بيوكيميائية ومصلية مناسبة.

3- أوساط الزرع الكواشف و الأمصال : 1.3 المكونات الأساسية :

لتحسين نسخ النتائج، ينصح باستعمال، من أجل تحضير أوساط الزرع ، مكونات منزوعة الماء في الأصل أو أوساط كاملة منزوعة الماء.

المواد الكيميائية المستعملة لتحضير أوساط الزرع و الكواشف يجب أن تكون ذات نوعية تحليلية معترف بها.

الماء المستعمل يجب أن يكون ماء مقطرا أو خال من الأملاح المعدنية ، و خال من المواد التي بإمكانها أن تعيق نمو الأعضاء المجهرية الدقيقة في الظروف التجريبية.

عندما يحدد الهلام ، المقدار المستعمل يجب أن يتغير وفق المعلومات المذكورة لإعطاء أوساط ذات ثبات مناسب.

يجب أن تجرى قياسات العامل الهيدروجيني بواسطة جهاز خاص به يدعى جهاز العامل الهيدروجيني (pH متر). هذه القياسات ترجع إلى درجة 25 م. التعديلات الملائمة تنجز بإضافة ، إما محلول حامض الكلور يدريك ل امول / لتر، و إما محلول هيدروكسيد الصوديوم ل 1 مول / لتر.

لا تستعمل أوساط الزرع و الكواشف فورا بل يجب أن تحفظ في الظلام ، في درجة حرارة 4 ± 1° م لمدة شهر على الأكثر، في ظروف تمنع كل تغيير في تركيبها إلا في حالة وجود تعليمات مخالفة. 2.3 أوساط الزرع 1.2.3 وسط ذو اغتناء مسبق ماء بيبتوني مثبت التركيب بيبتون. 10,0 غ كلورور الصوديوم 5,0 غ هيدروجينو - أورتو - فوسفات، ثنائي الصوديوم ثنائي عشاري مميه (Na2HPO4,12H2O)......9,0 غ ثنائي هيدروجينو- اورتو - فوسفات البوتاسيوم ..... ( KH2PO4 ) . 1,5 الماء 1000 ملل التحضير :

- تذوب المكونات في الماء حتى الغليان.

يعدل العامل الهيدروجين (PH) بحيث بعد التعقيم يكون 7،0 ± 0،1.

يوزع الوسط بمقادير 225 ملل، داخل قارورات سعتها 500 ملل( أو مضاعفات 225 ملل داخل قارورات سعتها مناسبة).

يعقم الوسط لمدة 15 دقيقة في 121 ± 1°م 2.2.3 وسط للاغتناء انتقائي: مرق الرباعي التيونات (مولير - كوفمان) الأخضر اللامع 0,5 الماء 100 ملل 1.2.2.3 الوسط الأساسي التركيب :

مستخلص اللحم. 5,0 بيبتون .. 10,0 غ كلورور الصوديوم. 3,0 غ كربونات الكالسيوم . 45,0 غ الماء ............. 1000 ملل التحضير :

تضاف المكونات الأساسية منزوعة الماء أو الوسط الأساسي الكامل و المنزوع الماء إلى الماء، ليصل إلى الغليان حتى الذوبان الكامل للمكونات المنحلة.

يعدل العامل الهيدروجيني (PH) بحيث بعد التعقيم يكون 7،0 ± 0،1.

- يعقم الوسط الأساسي لمدة 15 دقيقة في 121 ± 1°م 2.2.2.3 محلول تيوسلفات الصوديوم التركيب :

تيوسلفات الصوديوم خماسي الإماهة ) 5H20 Na2S203 ( 50,0 الماء كمية كافية ل....... 100 ملل التحضير:

يذوب تيوسلفات الصوديوم داخل جزء من الماء.

- يكمل إلى الحجم النهائي.

يعقم المحلول لمدة 15 دقيقة في 121 ± 1°م 3.2.2.3 محلول اليود التركيب :

اليود 20,0 غ إيودور البوتاسيوم 25,0 غ الماء ، كمية كافية ل....... 100 ملل التحضير:

- يذوب إيودور البوتاسيوم داخل حجم قليل من الماء، ثم يضاف اليود.

نرج إلى غاية الذوبان الكامل.

يكمل إلى الحجم النهائي.

يحفظ المحلول داخل إناء داكن مغلق بصفة كاملة. 4.2.2.3 محلول الأخضر اللامع التركيب الأخضر اللامع 0,5 غ الماء 100 ملل التحضير :

- يضاف الأخضر اللامع إلى الماء .

يحفظ المحلول على الأقل يوم واحد في الظلام للحصول على التعقيم الذاتي 5.2.2.3 محلول مرارة البقرة التركيب :

مرارة البقرة المجففة. 10,0 غ ........... 100 ملل التحضير :

- تذوب مرارة البقرة المجففة داخل الماء حتى الغليان.

يعقم المحلول لمدة 15 دقيقة في 121 ± 1م 6.2.2.3 الوسط الكامل التركيب الوسط الأساسي (1.2.2.3) .............. 900 ملل محلول تيوسلفات الصوديوم (2.2.2.3) ....... 100ملل محلول اليود ( 3.2.2.3 ) 20 ملل محلول الأخضر اللامع (4.2.2.3 )................. 2 ملل محلول مرارة البقرة ( 5.2.2.3). 50 ملل 15 يونيو سنة 2005 م التحضير :

يضاف بطهارة إلى الوسط الأساسي المكونات الأخرى بالترتيب المعطى أعلاه . نخلط بعناية المحاليل بعد كل إضافة .

يوزع بطهارة الوسط الكامل بمقادير 100 ملل ، داخل قارورات معقمة سعتها 500 ملل.

يحفظ في 0,5 م في الظلام مع استعماله في الأسبوع الموالي للتحضير. 3.2.3 أول وسط للتعريف :

هلام بالأحمر الفينول و الأخضر اللامع (إدال وكامبلماشر) 1.3.2.3 الوسط الأساسي التركيب :

مستخلص مسحوق اللحم 5,0 غ بيبتون. 10,0 غ مستخلص مسحوق الخميرة. 3,0 هيدروجينو- اورتو - فوسفات ثنائي الصوديوم ) Na2HPO4 ( 1,0 ثنائي هيدروجينو- اورتو - فوسفات الصوديوم(NaH2PO4). .................

أغار - أغار 12,0 إلى 18,00 .......... 900 ملل التحضير :

تذوب المكونات الأساسية منزوعة الماء أو الوسط الأساسي الكامل المنزوع الماء داخل الماء حتى الغليان.

- يعدل العامل الهيدر وجيني بحيث بعد التعقيم يكون 7،0 ± 0،1.

يوزع الوسط الأساسي داخل أنابيب أو في قارورات معقمة سعتها القصوى 500 ملل. 2.3.2.3 محلول السكر بأحمر الفينول التركيب :

لاكتوز. 10,0 سكاروز 10,0 أحمر الفينول. 0,09 غ الماء، كمية كافية ل............. 100 ملل التحضير:

تذوب المكونات في الماء.

تسخن داخل الحمام المائي لمدة 20 دقيقة 70 م .في تبرد في 55°م مع استعمالها مباشرة . 3.3.2.3 الوسط الكامل التركيب :

الوسط الأساسي (1.3.2.3). 900 ملل محلول سكر الأحمر الفينول (2.3.2.3).......... 100 ملل محلول الأخضر اللامع (4.2.2.3).......................1ملل التحضير:

يضاف بطهارة محلول الأخضر اللامع إلى محلول سكر الأحمر الفينول المبرد في 55°م.

يضاف إلى الوسط الأساسي المذوب و المثبت في 50 م إلى 55°م ويخلط. 4.3.2.3 تحضير العلب :

- يوزع الوسط الكامل المبرد في 45°م ، بكميات حوالي 15 ملل داخل علب بيتري المعقمة قطرها 90 مم ويترك ليتجمد.

- قبل الاستعمال، تجفف و بعناية علب الوسط الهلامي من الأفضل بعد سحب الأغلفة و تقليب العلب داخل محضن أو مجفف معدل في 50 ± 5°م لمدة 30 دقيقة.

يجب عدم الاحتفاظ بعلب الوسط الهلامي غير الجافة، أكثر من 4 ساعات في درجة حرارة المخبر أو أكثر من 24 ساعة في 0 م إلى 5°م. 4.2.3 ثاني وسط للتعريف : هلام لسلفيت البسميث التركيب :

بيبتون 10,0 غ مستخلص البقرة 5,0 غ غلوكوز 5,0 هيدروجينو - اورتو - فوسفات ثنائي الصوديوم ...... 4,0 سولفات الحديد. ... ) II ( . 03 سيترات البسميث أمونياكال. 1,85 غ سلفيت الصوديوم 6,15 أغار - أغار . 20,0 غ الأخضر اللامع. 0,025 غ الماء 1000 ملل التحضير :

- تذوب المكونات في الماء حتى الغليان لمدة حوالي دقيقة واحدة.

يعدل العامل الهيدروجيني (PH) إلى 7،7 ± 0،1.

- يبرد بين 45 م و 50°م مع الخلط ببطء الراسب المعلق.

لا يعقم الوسط.

يوزع الوسط ، بكميات 20 ملل داخل علب بيتري معقمة قطرها 90 مم و يترك ليتجمد.

مباشرة قبل الاستعمال، تجفف و بعناية علب الوسط الهلامي و من الأفضل بعد أن تسحب الأغلفة وتقلب العلب، داخل محضن أو مجفف معدل في 50 ± °5 °5م. لمدة 30 دقيقة.

تستعمل العلب الجافة بين 24 و 48 ساعة بعد تحضيرها. تحفظ في الظلام. 5.2.3 الهلام المغذي التركيب :

مستخلص اللحم. 3,0 غ بيبتون 5,0 غ أغار - أغار 12,0 غ ........... 1000 ملل التحضير :

تذوب المكونات منزوعة الماء للوسط أو الوسط الكامل المنزوع الماء داخل الماء، حتى الغليان.

يعدل العامل الهدروجيني (PH) بحيث بعد التعقيم يكون 7،0 ± 0،1.

يوزع وسط الزرع داخل أنابيب أو قارورات معقمة سعتها القصوى 500 ملل.

يعقم الوسط لمدة 20 دقيقة في 121 1°م تحضير علب الهلام المغذي تسكب حوالي 15 ملل من الوسط الذائب داخل علب بيتري المعقمة (قطرها 90 مم) و تنجز مثل ما هو مذكور في ( 4.3.2.3 ) 6.2.3 الهلام بسترات الحديد و بثلاثة أنواع من السكر (هلام TSI) التركيب مستخلص اللحم.

مستخلص الخميرة. 3,0 غ بيبتون 20,0 كلورور الصوديوم. 5,0 غ لاكتوز .. 10,0 غ سكاروز 10,0 غ غلوكوز 1,0 غ سيترات الحديد (III) 03 تيوسلفات الصوديوم. 0,3 غ أحمر الفينول . 0,024 غ أغار - أغار .... 12,0 غ الماء 1000 ملل التحضير :

- تذوب مكونات الوسط منزوعة الماء أو الوسط الكامل المنزوع الماء داخل الماء حتى الغليان.

- يعدل العامل الهيدروجيني (PH) بحيث يكون بعد التعقيم 7،4 ± 0،1 .

يوزع الوسط بمقادير 10 ملل داخل أنابيب قطرها بين 17 و 18مم.

يعقم الوسط لمدة 10 دقائق في 121 ± 1°م

- يترك للراحة في وضعية مائلة من خلالها نتحصل على راسب عمقه 2,5 سم و بميل مقدر بين 4 و 5 سم. 7.2.3 هلام من أجل البحث على إنزيم اليورياز (كليريستينسان). 1.7.2.3 الوسط الأساسي التركيب :

بيبتون. 1,0 غ غلوكوز 1,0 كلورور الصوديوم 5,0 غ ثنائي هيدروجينو- اورتو - فوسفات البوتاسيوم ) KH2PO4 ( . 2,0 احمر الفينول 0.012 أغار - أغار . 15,0 غ ماء ............ 1000 ملل التحضير :

تذوب المكونات الأساسية منزوعة الماء أو الوسط الكامل المنزوع الماء في الماء حتى الغليان يعدل العامل الهيدروجيني PH إذا اقتضى الأمر بحيث بعد التعقيم يكون 6،8 + 01.

- يعقم الوسط الأساسي لمدة 15 دقيقة في 121 ± 1°م 15 يونيو سنة 2005 م 2.7.2.3 محلول اليوريا :

التركيب :

اليوريا... 400 غ الماء، كمية كافية ل 1000 ملل التحضير:

- تذوب اليوريا في الماء.

يعقم بالترشيح و يراقب التعقيم. (حسب تقنية التعقيم بالترشيح). 3.7.2.3 الوسط الكامل :

التركيب :

الوسط الأساسي (1.7.2.3) 950 ملل محلول اليوريا ( 2.7.2.3 ) 50 ملل التحضير :

يضاف بطهارة محلول اليوريا إلى الوسط الأساسي المذوب مسبقا، ثم يبرد في 45°م.

- يوزع الوسط الكامل بمقادير 10ملل داخل أنابيب معقمة .

يترك للراحة في وضعية مائلة. 3.2.8 وسط لاختزال الكربون لليزين التركيب :

أحادي هيدروكلورور - ل- لين ....................

مستخلص الخميرة 3,0 غلوكوز 1,0 أرجواني بروموكريزول. 0,015 غ الماء ... 1000 ملل التحضير :

تذوب المكونات في الماء حتى الغليان.

يعدل العامل الهيدروجيني (PH) بحيث بعد التعقيم يكون 7،0 ± 0،1.

يوزع الوسط بكميات 5 ملل داخل أنابيب الزرع قطرها حوالي 8 مم و طولها حوالي 160مم يعقم الوسط لمدة 10 دقائق في 121 ± 1°م. 3.3 الكواشف : 1.3.3 محلول مالح :

التركيب :

كلورور الصوديوم 8,5 غ الماء 1000 ملل التحضير :

– يذوب كلورور الصوديوم داخل الماء حتى الغليان.

- يعدل العامل الهيدروجيني (pH) بحيث يكون بعد التعقيم 70±01.

- يوزع المحلول داخل قارورات أو أنابيب بحيث بعد التعقيم، تكون تحتوي على 90 إلى 100 ملل من المحلول.

- يعقم المحلول لمدة 15 دقيقة في 121 ± 1°م. 2.3.3 كواشف للبحث على B - غلاكتوزيداز : 1.2.3.3 التوليان : 2.2.3.3 محلول مثبت :

التركيب :

ثنائي هيدرو - اورتو - فوسفات الصوديوم ) NaH2PO4 ( . 6,9 هيدروكسيد الصوديوم، محلول لحوالي 0.1 مول / لتر 3 ملل الماء، كمية كافية ل .. 50 ملل التحضير :

- يذوب ثنائي هيدروجينو – اورتو - فوسفات الصوديوم داخل حوالي 45 ملل من الماء.

- يعدل العامل الهيدروجيني (pH) في 0,17,0 بواسطة حوالي 3 ملل من محلول هيدروكسيد الصوديوم.

يكمل إلى 50 ملل بالماء . 3.2.3.3 محلول اور تو نيتروفينول -D- -D-B- غلكتوبير انوزيد (ONPG) التركيب : ) ONPG ( . 0,08 الماء 15 ملل التحضير :

– تذوب (ONPG) داخل الماء في 50°م يبرد المحلول. 4.2.3.3 الكاشف الكامل :

التركيب :

محلول مثبت ( 2.2.3.3 ) .......... ملل محلول ( ONPG ) ( . 2.3.3 . 3 ) ................ 15 ملل التحضير :

يضاف محلول مثبت إلى محلول (ONPG) 3.3.3 كواشف من أجل تفاعل فوجس - بروسكاور (V.P) (طريقة سريعة لباري و فني) 1.3.3.3 وسط . :

التركيب :

بيبتون 7,0 غ غلوكوز . 50 هيدروجينو- اورتو - فوسفات ثنائي البوتاسيوم K2HPO4 .... 5,0 الماء 1000 ملل التحضير :

تذوب المكونات داخل الماء.

- يعدل العامل الهيدروجيني (pH) بحيث بعد التعقيم يكون 70±01.

- توزع 3 ملل من الوسط داخل كل أنبوب.

- يعقم الوسط لمدة 15 دقيقة على الأكثر في 1121م 2.3.3.3 محلول الكرياتين :

التركيب :

كرياتين أحادي الإماهة (ن- اميدينوساركوزين). 05 الماء 100 ملل التحضير :

يذوب الكرياتين أحادي الإماهة داخل الماء. 3.3.3.3 محلول إيتانوليك نافتول -1 التركيب :

نافتول -1. غ إيتانول (96% (ح/ ح) غ 100 ملل التحضير :

يذوب النافتول -1 داخل الإيتانول. 4.3.3.3 محلول هيدروكسيد البوتاسيوم :

التركيب :

هيدروكسيد البوتاسيوم 40 غ ............ 100 ملل التحضير :

يذوب هيدروكسيد البوتاسيوم داخل الماء . 4.3.3 كواشف من أجل تفاعل الإندول : 1.4.3.3 وسط تريبتون-تريبتوفان ( ل - جيتوف) :

التركيب :

تريبتون 10 غ كلورور الصوديوم 5 غ

د - ل تريبتوفان اغ الماء 1000 ملل التحضير :

- تذوب المكونات داخل الماء حتى الغليان يرشح.

يعدل العامل الهدروجيني (pH) بحيث بعد التعقيم يكون 7,5±01.

- توزع 5 ملل من الوسط في كل أنبوب يعقم الوسط لمدة 15 دقيقة في 121 ± 1°م 2.4.3.3 كاشف الكوفاكس :

التركيب :

ثنائي ميتيل لارنينو -4 بنزا الدهيد .............5غ حمض كلوريدريك ، 1,18 إلى 1,19 ملل 25 ملل مثيل - 2 بوتانول - 2. 75 ملل التحضير :

تخلط المكونات. 5.3.3 الهلام المغذي النصف صلب :

التركيب :

مستخلص اللحم .... 30 بيبتون أغار - أغار .... 4 إلى وغ ............... 1000 ملل التحضير:

تذوب المكونات الأساسية منزوعة الماء داخل الماء حتى الغليان يعدل العامل الهدروجيني (pH) بحيث بعد التعقيم يكون 0,170

- يوزع الوسط داخل قارورات سعتها القصوى ملل .500 يعقم الوسط لمدة 15 دقيقة في 121 ± 1°م. 15 يونيو سنة 2005 م تحضير علب الهلام :

يوزع الوسط الكامل ، حديث التحضير ، داخل علب بيتري بكميات 15 ملل، يجب أن لا تجفف العلب. 4.3 أمصال :

يمكن أن توجد عدة أمصال ضد السالمونيلا تحتوي على واحد أو عدة مجموعات صنف "0" (تسمى مضادات المصل "0" أحادي الاختصاص أو متعدد الاختصاص) . مضادات المصل VI ومضادات المصل المحتواة على مضادات حيوية لواحد أو عدة عوامل "H"

(تسمى مضادات المصل "H ८८ “ أحادي الاختصاص تتبع إرشادات الاستعمال لكل مصل.

4 - الأجهزة و الأواني :

التجهيزات العادية للمخبر الميكروبيولوجي، لا سيما : 1.4 الأجهزة : 1.1.4 أجهزة التعقيم بالحرارة الجافة (مثل الفرن أو بواسطة الحرارة الرطبة (جهاز التعقيم) :

يجب أن تكون الأجهزة الملامسة لأوساط الزرع ، المخفف و العينة، معقمة ما عدا المعقمة مسبقا خاصة التي تكون من البلاستيك :

سواء بالفرن المثبت في درجة حرارة تتراوح بين 170م و175°م لمدة ساعة على الأقل.

- أو بواسطة جهاز التعقيم المثبت في 121 1° لمدة 20 دقيقة على الأقل جهاز التعقيم ضروري أيضا لتعقيم أوساط الزرع و كذلك الكواشف. يجب أن يكون معدل في 121 1°م 2.1.4 جهاز للتجفيف محضن أو مجفف ، مهوي يسمح بتجفيف سطح الأوساط الهلامية المسكوبة داخل العلب) ، معدلة في 50 5°م . 3.1.4 محضن معدل في 37 ± 1°م .

حضن معدل في 43 ± 0.5 م .4.1.4 5.1.4 حمام مائي معدل في 45 ±1°م وفي 37 ±1°م 6.1.4 أجهزة المجانسة :

يجب استعمال إحدى التجهيزات التالية :

أ) جهاز تجانس دوراني ، يعمل بتواتر دوراني يقدر ما بين 8000 و 45000 دورة / دقيقة بواسطة إناء زجاجي أو معدني, مزود من الأحسن بأغلفة مقاومة لظروف التعقيم.

ب جهاز تجانس من نوع البيريستالتيكي (péristaltique) مع أكياس بلاستيكية معقمة .

يجب أن تكون سعة الأواني أو الأكياس البلاستيكية كافية لإجراء الخلط الصحيح للعينة المأخوذة للتجربة مع المخفف. على العموم ، حجم الإناء يجب أن يعادل مرتين حجم العينة و كذا المخفف. 7.1.4 أسلاك الزرع الحلقية : من البلاتين غير مجعدة أو من النيكل - كروم قطرها حوالي 3 مم 8.1.4 جهاز لقياس العامل الهيدروجيني: (يسمح بقياس العامل الهيدروجيني (PH) للأوساط والكواشف المحضرة) بتدقيق مثبت ل±201 وحدة (PH) في م .25 9.1.4 ثلاجة : تستعمل لحفظ الأوساط والكواشف المحضرة معدلة بين 0° م - 5°م . 2.4 الأواني الزجاجية :

يجب أن تكون الأواني الزجاجية لها قابلية المقاومة ضد التعقيم المتكرر. 1.2.4 قارورات الزرع : من أجل التعقيم و حفظ أوساط الزرع وكذا تحضين الأوساط السائلة . 2.2.4 أنابيب الزرع : قطرها 8 مم و طولها 160مم، من أجل وسط منزوع الكربون لليزين. 3.2.4 قنينة مدرجة : من أجل تحضير الأوساط الكاملة 4.2.4 ماصات مدرجة : سعتها 10,25 و 1ملل مدرجة بالتسلسل 0,5 و 0.1 ملل 5.2.4 علب بيتري.

5 - المعايرة :

تتم المعايرة وفق شروط مناسبة.

6 - تحضير العينات للتجربة : 1.6 الحليب :

- رج بقوة العينة المأخوذة للتجربة لتحقيق توزيع عادل للأعضاء المجهرية ، بحيث تقلب و بسرعة 25 مرة الإناء و بداخله العينة، يجب تجنب تشكل الرغوة أو تترك لتتحلل.

يجب أن لا تتعدى المدة بين الخلط و اقتطاع العينة المأخوذة للتجربة 3 دقائق. 2.6 الحليب الجاف، مسحوق مصل الحليب أو مسحوق مخاض الزبدة ، لاكتوز ، كازيين :

- يخلط بعناية محتوى الوعاء المغلق بالرج اليدوي مع التقليب بطريقة متكررة ، إذا كان الوعاء جد مملوء، وللوصول إلى رج مقبول، يؤخذ وعاء أكبر منه يسمح بالخلط. 3.6 الزبدة :

تذوب العينة داخل إناء معقم داخل حمام مائي مثبت في 45°1°م ( 5.1.4 )

- يرج عند التذويب ثم يسحب الإناء مباشرة من الحمام المائي عندما تكون العينة كاملة الذوبان 4.6 الجبن :

عادة ما تمثل عينة واحدة (1) للمخبر ، العينة المأخوذة للتجربة مكونة لعينة التجربة نجري التجربة مثل ما هو مبين في (5.1.7) 5.6 مثلجات للاستهلاك :

نعمل بنفس الإجراءات المعمول بها في حالة الزبدة (3.6) لكن مع استعمال حمام مائي مثبت في 37 °37م (5.1.4) بحيث أن العينة لا تتجاوز درجة الحرارة هذه . 6.6 الحليب المخمر، الياهورت، القشدة المحلية :

يخلط محتوى الوعاء المغلق ، مع التحريك باليد و قلب الوعاء بطريقة متكررة ، ثم يفتح الوعاء و يخلط المحتوى بطهارة بواسطة ملعقة معقمة.

7 - طريقة العمل : 1.7 العينة المأخوذة للتجربة والاغتناء المسبق :

- ندخل العينة المأخوذة للتجربة داخل الوسط المغتني مسبقا وننجز العملية مثل ما هو مبين في ) 7.1.1.1.7

- من أجل اختصار طرق العمل للاغتناء و الاغتناء المسبق، يرجع إلى الجدول 1. 1.1.7 الحليب :

الاغتناء المسبق غير ضروري، يرجع إلى (2.7) باستعمال على التوالي 25 ملل من العينة المأخوذة للتجربة و 225 ملل من الوسط المغذي. 2.1.7 الحليب الجاف :

تحضر قارورة مسدودة محتواة على 225 ملل من الماء المقطر معقم و املل من محلول الأخضر اللامع (4.2.2.3) توزن بطهارة 25 غ من العينة المأخوذة للتجربة و تسكب على سطح السائل الموجود داخل القارورة.

تسد القارورة ، مع عدم الخلط ، يترك للراحة في درجة حرارية عادية لمدة 60 ± 10دقيقة، هذا قبل التحضين. تعديل العامل الهيدروجيني (PH) غير ضروري .

إذا كان الحليب الجاف لم ينحل بعد 3 ساعات من التحضين ، يخلط محتوى القارورة بالرج 3.1.7 الحليب الجاف، مخاض زبدة الحليب الجاف:

- يوزن بطهارة ، 25 غ من العينة المأخوذة للتجربة داخل قارورة مسدودة محتواة على 225 ملل من الماء المقطر المعقم.

- يرج إلى غاية الانحلال و يضاف املل من الأخضر اللامع (4.2.2.3) 4.1.7 لاكتوز :

يوزن بطهارة 25 غ من العينة المأخوذة للتجربة داخل قارورة مسدودة محتواة على 225 ملل من الوسط المغتني مسبقا (1.2.3) مع الرج إلى غاية الانحلال. 5.1.7 كازيين الجبن :

- توزن وبصفة نظيفة 25 غ من العينة المأخوذة للتجربة داخل وعاء معقم مرفق بجهاز المجانسة ذو سرعة كبيرة أو من النوع بيريستالتيك (Péristaltique).

(6.1.4) مع إضافة 225 ملل من الوسط المغتني (1.2.3) في45°م .مسبقا

- تخلط إلى غاية أن تكون العينة كاملة التوزيع (من 1 إلى 3 دقائق)

- التأكد من أن درجة حرارة التوزيع لا تتعدى م .45 6.1.7 الزبدة :

ترج العينة المأخوذة للتجربة المذوبة وبواسطة ماصة مع إيصالها إلى درجة حرارية قدرها 45م، مع إدخال 25 ملل داخل قارورة محتواة على 225 ملل من الوسط المغذي مسبقا (1.2.3) مع الخلط. 7.1.7 منتجات الحليب المجمدة (بما في ذلك مثلجات الاستهلاك):

تدخل بواسطة ماصة 25 ملل من العينة للتجربة و المذوبة داخل قارورة محتواة على 225 ملل من الوسط المغذي مسبقا (1.2.3) مع الخلط. 15 يونيو سنة 2005 م 8.1.7 الحليب المخمر، ياهورت، قشدة محلية :

- توزن بطهارة 25 غرام من العينة للتجربة داخل قارورة مسدودة محتواة على كريات زجاجية و على 225 ملل من الوسط المغذي مسبقا (1.2.3) مع الرج من أجل الانحلال.

- يراقب العامل الهيدروجيني (PH) ويعدل إذا اقتضى الأمر إلى 7،0 ما لم توجد تعليمات مخالفة لذلك 9.1.7 التحضين :

تحضن القارورات المحضرة وفق (2.1.7) إلى ( ) في37°م لمدة 16-20 ساعة .8.1.7 2.7 الاغتناء : 1.2.7 : ننقل بواسطة ماصة 10 ملل من الوسط المغذي مسبقا المحضن (1.7) في قارورة محتواة على 100 ملل من الوسط المغذي الانتقائي برباعي التيونات ( 2.2.3 ) في حالة الحليب، ننقل و بطهارة 25 ملل من العينة المأخوذة للتجربة في 225 ملل من الوسط برباعي تيونات (2.2.3) 2.2.7 : يحضن الوسط بالرباعي التيونات المزروع لمدة 18 إلى 24 ساعة في 43° ± 0.5°م. 3.7 الزرع و التعريف : 1.3.7 : انطلاقا من الزرع للوسط المغذي يزرع بواسطة سلك الزرع سطح العلبة المعبأة بالهلام المكون من الأخضر اللامع و الأحمر الفينول (3.2.3) وعلبة أخرى معبأة بهلام سلفيت البيسميث (4.2.3) بطريقة تسمح بنمو مستعمرات جد منفصلة.

يعاد وضع وسط الاغتناء للتحضين (لاحظ 3.3.7) 2.3.7 : تحضن العلب ( مقلوبة) في 37 ± 1° م . لمدة 24-20 ساعة. 3.3.7 : بعد تحضين القارورات لمدة 18-24 ساعة تعاد عمليات الزرع و كذلك التحضين المذكورة في 2.3.1.3.7 4.3.7 بعد التحضين تختبر العلب ( 2.3.7 و 3.3.7) للبحث على وجود مستعمرات مطابقة للسالمونيلا. إذا كان النمو ضعيفا ولا توجد مستعمرات مطابقة للسالمونيلا، تحضن من جديد العلب في 37 + 1 م . لمدة 24-18 ساعة ويعاد اختبار العلب من أجل البحث عن المستعمرات المطابقة للسالمونيلا. 5.3.7 : المستعمرات المطابقة للسالمونيلا يمكن أن تتميز على النحو الآتي :

– تكون المستعمرات المطابقة للسالمونيلا على الهلام بالأخضر اللامع / أحمر الفينول (3.2.3) وردية محاطة بالأحمر.

- تكون المستعمرات المطابقة للسالمونيلا على الهلام بالسلفيت البسيميث (4.2.3) بنية أو سوداء مع بريق معدني، بعض السلالات تعطى مستعمرات خضراء.

جدول -1 الموجز لطرق العمل للاغتناء المسبق والاغتناء المادة كمية العينة الوسط المغذي مسبقا الحليب 50 ملل 2 x 25 ملل لا يوجد حليب جاف 25 غ ماء مقطر + محلول الأخضر اللامع مصل الحليب الجاف 25 غ ماء مقطر + محلول مخاض زبدة جافة الأخضر اللامع لاكتوز 25 غ 225 ملل ماء بيتوني مثبت كازيين الجبن 25 225 ملل ماء بيتوني مثبت الزبدة 25 غ 225 ملل ماء بيتوني مثبت منتوجات حليبية مجمدة 25 ملل 225 ملل ماء بيتوني مثبت حليب مخمر ياهورت 25 غ 225 ملل ماء بيتوني قشدة محلية مثبت * طريقة التحضير الوسط المغذي تخلط 225 ملل من رباعي التيونات يبلل لمدة 60 ± 10 100 ملل من رباعي دقائق لا يخلط ** التيونات تخلط 100 ملل من رباعي التيونات يخلط 100 ملل من رباعي التيونات يخلط في 45°م على 100 ملل من رباعي الأكثر التيونات يخلط 100 ملل من رباعي التيونات يخلط 100 ملل من رباعي التيونات يخلط 100 ملل من رباعي التيونات * إذا كان الوسط المغذي مسبقا قد أستعمل بعد التحضين لمدة 20 ساعة في 37° م ، نعيد زرع 10 ملل من العينة المحضنة و تخلط مع الوسط المغذي مسبقا داخل الوسط المغذي . ** إذا لم يذوب الحليب الجاف بعد 3 ساعات من التحضين، يخلط محتوى القارورات عن طريق الرج. 4.7 الإثبات : 1.4.7 اختيار المستعمرات من أجل الإثبات :

انطلاقا من كل علبة لكل الأوساط الاختيارية (5.3.7)، تقتطع 5 مستعمرات نموذجية أو مشبوهة أو لو وجدت أقل من 5 مستعمرات نموذجية أو مشبوهة.

تقتطع كلها للإثبات. 2.4.7 التحضين :

تزرع المستعمرات المختارة على سطح علب الهلام المغذي (5.2.3) بطريقة تسمح بنمو المستعمرات جد منفصلة و تحضن العلب في 37 ± 1°م لمدة 18-24 ساعة.

بعد التحضين يحتفظ بالمستعمرات النقية الجد منفصلة من أجل الإثبات البيوكميائي و المصلي. 3.4.7 الإثبات البيوكيميائي :

بواسطة خيط للزرع، تزرع الأوساط الآتية بواسطة المستعمرات الخالصة. 1.3.4.7 هلام بسترات الحديد و بثلات أنواع من السكر ( TSI ) ( 6.2.3 يزرع ميل الهلام بطريقة الخطوط ويزرع في القعر بالوخز.

يحضن لمدة 24 ساعة في 37 ± 1°م .

تفسر تغييرات الوسط بالطريقة الآتية :

القعر :

لون أصفر ........... غلوكوز إيجابي (تخمر الغلوكوز) لون أحمر أو عدم تبدله .......... غلوكوز سلبي (عدم تخمر الغلوكوز) اللون الأسود ............ تشكيل كبريت الهيدروجين.

فقاعات أو تشققات ........ تكوين غازات انطلاقا من الغلوكوز الميل :

لون أصفر ....... لاكتوز و / أو سكاروز موجب (تخمر اللاكتوز و / أو السكاروز).

لون أحمر أو عدم تبدله لاكتوز و سكاروز سالب (عدم تخمر اللاكتوز ولا السكاروز). 2.3.4.7 هلام للبحث عن إنزيم اليوريا (7.2.3) :

يزرع بطريقة الخطوط ميل الهلام. يحضن لمدة 24 ساعة في 37 ± 1°م. عندما يكون التفاعل موجبا ينتج إنزيم اليوريا تسرب الأمونياك و يعمل على تحويل الأحمر الفينول إلى اللون الوردي ثم إلى اللون الأحمر العاتم. 15 يونيو سنة 2005 م 3.3.4.7 وسط اختزال كربون الزين ( 8.2.3 ) :

- يزرع الوسط مباشرة تحت سطح السائل.

يحضن لمدة 24 ساعة في 37 ± 1°م.

لون بنفسجي بعد التحضين يدل على تفاعل موجب.

لون أصفر يدل على تفاعل سلبي. 4.3.4.7 كاشف للبحث على B - غلاكتوزيداز ) 2.3.3 ( :

- يوضع على شكل معلق قبضة من المستعمرة المشبوهة داخل أنبوب يحتوي على 0.25 ملل من المحلول الملحي (1.3.3).

- ثم تضاف قطرة من التوليان ، ثم يرج الأنبوب.

يوضع الأنبوب داخل حمام مائي في 37 ± 1م.

لعدة دقائق.

- يضاف 0,25 ملل من الكاشف للبحث عن B - غلاكتوزيداز ، ثم يخلط.

يعاد وضع الأنبوب داخل الحمام المائي في37 ± 1°م. لمدة 24 ساعة .

لون أصفر يدل على تفاعل موجب.

- التفاعل عادة مرئي في حدود 20 دقيقة. 5.3.4.7 وسط لتفاعل فوكس بروسكاور (V.P) ) 3.3.3 ( :

يزرع أنبوبان بواسطة معلق لقبضة من المستعمرة المشبوهة داخل 0.2 ملل من وسط (V.P) (1.3.3.3) داخل كل أنبوب.

- يحضن أنبوب في درجة حرارة عادية والآخر في37 ± 1°م. لمدة 24 ساعة.

بعد التحضين يضاف إلى كل أنبوب قطرتين من محلول الكرياتين (2.3.3.3)، 3 قطرات من محلول إيتانوليك النافتول- 1 (3.3.3.3) ، ثم قطرتان من محلول هيدروكسيد البوتاسيوم (4.3.3.3)، يخلط الأنبوبان بعد إضافة كل كاشف تغير اللون الوردي إلى اللون الأحمر الفاتح خلال 15 دقائق يدل على تفاعل موجب. 6.3.4.7 وسط من أجل تفاعل الأندول ( 4.3.3 ) :

- يزرع بواسطة جزء من المستعمرة أنبوب يحتوي على 5 ملل من وسط تريبتون- تريبتوفان ) 1.4.3.3 (

- يحضن لمدة 24 ساعة في 37 ± 1°م .

- بعد التحضين ، تضاف قطرتين أو ثلاث قطرات من كاشف الكوفاكس (2.4.3.3).

و تشكل حلقة حمراء تدل على تفاعل موجب.

وتشكل حلقة صفراء بنية تدل على تفاعل سالب.

الجدول 2 تفسير النتائج تفاعل | النسبة المئوية تجارب الإثبات موجب لسلالة السالمونيلا أو سالب الممثلة للتفاعل غلوكوز TSI (تكوين حمض) + 100 ) 1.3.4.7 ( غلوكوز TSI (تشكل غاز) ) 1.3.4.7 ( + 91,9 لاكتوز TSI ( 1.3.4.7

- (1) 99,2 سكار TSI ( 1.3.4.7 ) 99,5 كبريتات الهيدروجين TSI ) 2.3.4.7 ( + 91,6 تفكيك اليوريا ( 2.3.4.7 ) 100 اختزال كربون الليزين ) 3.3.4.7 ( + 94,6 تفاعل B - غلاكتوزيداز ) 4.3.4.7 ( - (2) 98,5 تفاعل فوكس بروسكاور ) VP ( ) 5.3.4.7 ( 100 تفاعل الاندول ( 6.3.4.7 ) 98,9 تفسير التجارب البيوكيميائية :

تفسير النتائج وفق الجدول 2 :

الجدول 2 تفسير النتائج (أنظر جدول (2)

(1) السالمونيلا متفرعة من النوع الثالث (أريزونا) تعطي تفاعل موجب أو سالب باللاكتوز ولكن دائما تفاعل موجب ل B - غلاكتوزيداز

(2) لسالمونيلا من النوع الثاني ، تعطي تفاعل سلبي للاكتوز، و لكنها يمكن أن تعطي تفاعل موجب ل B- غلاكتوزيداز. 4.4.7 منهج التشخيص السريع :

إن مناهج التشخيص السريع أنظر إلى التنبيه في (1.3) يمكن أن تستعمل في مكان العمليات المبينة في (3.4.7) من أجل الإثبات البيوكيميائي للمستعمرات النموذجية أو المشكوك فيها .

في هذه الحالة، فإن تعليمات الاستعمال يجب أن تتبع بدقة . 5.4.7 الإثبات المصلي :

يجرى الكشف عن وجود مولدات الضد 0، H،Vi ، H للسالمونيلا بواسطة تخثر على سطح صفيحة بواسطة أمصال مناسبة ، فوق مستعمرات نقية (1.4.7) بعد التخلص من السلالات ذات التخثر الذاتي. 1.5.4.7 التخلص من السلالات ذات التخثر الذاتي:

توضع على سطح صفيحة جد نظيفة قطرة من محلول مالح (1.3.3).

يوزع داخل هذه القطرة جزء من المستعمرة (2.4.7) لمحاولة الحصول على معلق متجانس ومعكر تخضع الصفيحة إلى تذبذب لمدة 30 إلى 60 ثانية.

- ملاحظة النتائج على قعر أسود و من المستحسن بواسطة عدسة مكبرة .

تعتبر السلالات ذاتية التخثر إذا تجلطت الجراثيم إلى أكداس على الأقل متشابهة. يعتبر الإثبات المصلي لهذه السلالات ذاتية التخثر مستحيل من خلال طريقة العمل المبينة في (2.5.4.7)،(3.5.4.7) 4.5.4.7 2.5.4.7 إظهار لمولد الضد :

- تستعمل سلالات خالصة ( 2.4.7) غير ذاتية التخثر ( 1.5.4.7

- تجرى العملية كما هو مبين في (1.5.4.7) لكن باستعمال قطرة من المضاد المصلي 0. (4.3) عوض المحلول المملح .

تستعمل الأمصال أحادية أو متعددة الخدمات الواحدة تلوى الأخرى . 3.5.4.7 إظهار لمولد الضد Vi :

تنجز العملية كما هو مذكور في (2.5.4.7) لكن باستعمال قطرة من المضاد المصلي 1 (4.3) عوض المحلول المملح . 4.5.4.7 إظهار لمولد الضد H :

- يزرع الهلام المغذي النصف صلب (5.3.3) بواسطة سلالة خالصة غير ذاتية التخثر ) 1.5.4.7 (

- يحضن الوسط لمدة 18 إلى 24 ساعة في 37 °1°م يستعمل هذا الزرع لاختبار مولد الضد H كما هو مذكور في (2.5.4.7)، باستعمال قطرة من المضاد المصلي ) (4.3) عوض المحلول المملح 5.5.4.7 تفسير التفاعلات المصلية :

إذا وجد تخثر ، اعتبرت التفاعلات إيجابية . 6.4.7 تفسير التفاعلات البيوكيميائية والمصلية 15 يونيو سنة 2005 م 1.6.4.7 تعتبر السلالات سالمونيلا إذا قدمت تفاعلات بيوكيميائية نموذجية (3.4.7 ) وتعطي تفاعلات مصلية موجبة كما هو مبين في ( 5.4.7 ) 2.6.4.7 السلالات التي تظهر تفاعلات بيوكيميائية نموذجية (3.4.7) ولكن لا تعطي تفاعلات مصلية موجبة وفق (5.4.7.)، السلالات التي لا تقدم تفاعلات بيوكيميائية نموذجية (3.4.7) و لكن تعطي تفاعلات مصلية موجبة وفق (5.4.7.). و السلالات ذاتية التخثر و التي تظهر تفاعلات بيوكيميائية نموذجية (3.4.7) يمكن أن تكون سالمونيلا . 3.6.4.7 إذا لم تظهر السلالات تفاعلات بيوكيميائية نموذجية (3.4.7) ولا تعطي تفاعلات مصلية موجبة وفق (5.4.7.) لا تعتبر سالمونيلا. 7.4.7 الاثبات النهائي بالنسبة للسلالات التي تعتبر سالمونيلا (1.6.4.7) أو التي يمكن اعتبارها كذلك (2.6.4.7) يجب اجراء تعريف للسالمونيلا من أجل إثبات التبيان النهائي من التفاعل المصلي

8 - زرع المراقبة من أجل التحقق من قدرة الأوساط الاغتناء والتأكد من تحمل نمو السالمونيلا، يجب استعمال سلالة مرجعية لسالمونيلا حديثة العزل من أجل مراقبة أوساط الاغتناء (لاحظ (2.7) يجب أن تتبع عمليات المراقبة، تلك الخاصة بالزرع و أجهزة التجريب، ليظهر لنا زرع المراقبة إيجابي.

9. تفسير النتائج وفق نتائج التفسير ، يصرح بوجود أو غياب السالمونيلا في العينة المأخوذة للتجربة، مع تحديد الكتلة بالغرام أو الحجم بالميليلتر من المنتوج المجرب.

مخطط لطريقة العمل العينة المأخوذة للتجربة 25 غ أو ملل وسط مغذي مسبقا : ماء ببتوني مثبت أو ماء مقطر + محلول الأخضر اللامع 225 ملل التحضين في 37°م لمدة 16-18 ساعة الاغتناء في وسط سائل اختياري 10 ملل من الزرع أو 25 ملل من عينة التجريب في حالة الحليب وسط برباعي التيونات على مرحلتين من 18 إلى 24 ساعة من التحضين في 37°م العزل على أوساط انتقائية داخل علب بيتري أول وسط هلام بالأحمر ثاني وسط الفينول والأخضر اللامع هلام بسلقيت البسيمث) التحضين في 37°م لمدة 20-24 ساعة ( 40-48 ساعة إذا اقتضى الأمر) 5 مستعمرات مميزة لكل علبة) تزرع فوق هلام مغذي التحضين في 37°م لمدة 18-24 ساعة الإثبات البيوكيميائي الاثبات المصلي تفسير النتائج