قرار مؤرخ في 4 ربيع الثاني عام 1425 الموافق 24 مايو سنة 2004 ، يجعل منهج البحث عن ستافيلوكوك ذات الكواقولاس الإيجابي في مسحوق الحليب إجباريا. 10

تطبيقا لأحكام المادة 19 من المرسوم التنفيذي رقم 90 – 39 المؤرخ في 3 رجب عام 1410 الموافق 30 يناير سنة 1990، المعدل والمتمم والمذكور أعلاه، يهدف هذا القرار إلى جعل منهج البحث عن ستافيلوكوك ذات الكواقولاس الإيجابي في مسحوق الحليب إجباريا.

من أجل البحث عن ستافيلوكوك ذات الكواقولاس الإيجابي في مسحوق الحليب، فإن مخابر رقابة الجودة وقمع الغش وتلك المعتمدة لهذا الغرض ملزمة باستعمال منهج التحليل الميكروبيولوجي المبين في الملحق.

كما يجب أن يستعمل المخبر هذا المنهج عند الأمر بإجراء خبرة.

ينشر هذا القرار في الجريدة الرسمية للجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية.

حرر بالجزائر في 4 ربيع الثاني عام 1425 الموافق 24 مايو سنة 2004.

نور الدين بوكروح الملحق منهج البحث عن ستافيلوكوك ذات الكواقولاس الإيجابي في مسحوق الحليب.

1. المبدأ :

ينقل الحليب المعاد تركيبه والموافق ل 0,1 غ من المسحوق في مرق مغذي (جيوليتي، وكانتوني أو ينقل في مرق مالح يحتوي على لاكتوز وأحمر الفينول)، إذا تعلق الأمر بمسحوق مصنوع منذ أقل من 15 يوما.

بعد التجفيف، نعيد زرع عينات من هذه الأنابيب في وسط ETGPA ل بيرد – باركر (3.3). تخضع مستعمرات ستافيلوكوك التي تنمو في وسط بيرد – باركر لاختبار الكواقولاس.

2. إعادة تركيب مسحوق الحليب وتحضير التخفيفات :

يتم إعادة تركيب مسحوق الحليب وتحضير التخفيفات وفق الشروط المناسبة.

3. تركيبة الأوساط والتوجيهات الخاصة بتحضيرها : 1.3. وسط جيوليتي وكانتوني 1.1.3 الوسط الأساسي تريبتون 10 غ مستخلص اللحم 5غ مستخلص الخميرة 5 غ كلورور الليتيوم 5 غ المانيتول 20 غ كلورور الصوديوم 5 غ الغليسين 1,2 غ بيروفات الصوديوم 3 غ ماء مقطر 1000 ملل تذوب هذه المواد في الماء بالتسخين والرج من أجل الحصول على ذوبان كامل.

نتركه يبرد في درجتي 50-60 م ثم يعدل العامل الهيدروجيني pH في 6,9 ± 0,1 يوزع الوسط في أنابيب 20 x 200 بمقدار 19 ملل. يعقم بواسطة جهاز التعقيم في درجة 115م لمدة 20 دقيقة. قبل الاستعمال، نخرج الهواء بواسطة التسخين في درجة 100 م لمدة 20 دقيقة، ثم نتركه يبرد. 2.1.3 محلول تلوريت البوتاسيوم محلول تلوريت البوتاسيوم ....... 1 غ ماء مقطر 100 مل يذوب تلوريت البوتاسيوم في الماء. يعقم بالترشيح.

ينبغي التأكد مسبقا عن طريق اختبارات بكتيريولوجية من أن تلوريت البوتاسيوم الذي بحوزتنا يناسب هذا الاستعمال. وينبغي إيلاء عناية كبيرة لذلك في جميع الظروف كما يجب اختيار هذه المادة بناء على مصدرها والضمانات التي يقدمها. 3.1.3 إضافة إلى ذلك، يحضر هلام بنسبة 2% داخل ماء مقطر) الذي يعقم في جهاز التعقيم في درجة 120 م لمدة 20 دقيقة والذي يستعمل لتكوين سدادة لاهوائية فوق الوسط السائل (أنظر 1.4). 12 الجريدة الرسمية للجمهورية 4.1.3 طريقة الاستعمال مباشرة قبل الاستعمال، تسخن أنابيب الوسط الأساسي (1.1.3) لمدة 20 دقيقة في درجة 100 م لإخراج الهواء. نتركها تبرد في درجة 45 م ويضاف 0.1 ملل من محلول تلوريت البوتاسيوم (2.1.3). 2.3 مرق مالح المحتوي على لاكتوز وأحمر الفينول مستخلص لحم البقر 1,5 غ بروتيوز - بيبتون 7,5 غ كلورور الصوديوم 75 غ لاكتوز 7,5 غ أحمر الفينول 0,025 غ ماء مقطر 1000 ملل تذوب المواد في الماء بالتسخين والرج من أجل الحصول على ذوبان كامل. نتركه يبرد في درجة حرارة معتدلة ويعدل العامل الهيدروجيني pH في 7,4 ± 0,1.

يوزع الوسط في أنابيب 18 x 180 بمقدار 9 ملل. يعقم بواسطة جهاز التعقيم في درجة 120 م لمدة 20 دقيقة. 3.3 وسط E.T.G.P.A ل بيرد باركر 1.3.3 الوسط الأساسي تريبتون 10 غ مستخلص البقر 5 غ مستخلص الخميرة 1 غ كلورور الليتيوم 5 غ هلام 15 إلى 20 غ (حسب قوة تجمد الهلام المستعمل) ماء مقطر 1000 ملل تذوب المواد في الماء بالتسخين والرج من أجل الحصول على ذوبان كامل. يبرد في درجتي 50-60 م ويعدل العامل الهيدروجيني في 6,8 01.

يوزع الوسط بمقدار 90 ملل في قارورات مغلقة بسدادات بلاستيكية غير قابلة للذوبان . تعقم بواسطة جهاز التعقيم لمدة 15 دقيقة في درجة 120 م. 2.3.3 محلول الغليسين الغليسين 20 غ ماء مقطر 100 ملل بعد التذويب الكامل، يعقم بواسطة جهاز التعقيم لمدة 15 دقيقة في درجة 120 م. 3.3.3 محلول تلوريت البوتاسيوم تلوريت البوتاسيوم 1 غ ماء مقطر 100 ملل بعد التذويب الكامل، نعقم بالترشيح.

ينبغي التأكد مسبقا عن طريق اختبارات بكتيريولوجية من أن تلوريت البوتاسيوم الذي بحوزتنا يناسب هذا الاستعمال. وينبغي إيلاء عناية كبيرة لذلك في جميع الظروف كما يجب اختيار هذه المادة بناء على مصدرها والضمانات التي تقدمها. 4.3.3 مستحلب صفار البيض يغمس البيض الطازج في محلول مشبع ب HgCI2 ذي تخفيف (1+1000) لمدة دقيقة واحدة.

تكسر قشرة البيض بصفة نظيفة ويفصل الصفار عن البياض. يمزج صفار البيض في محلول فيزيولوجي مالح (73، ح /ح) في خلاط ذي سرعة كبيرة لمدة خمس ثوان. 5.3.3. طريقة الاستعمال يضاف بطريقة نظيفة ل 90 ملل من الوسط الأساسي المذوب مسبقا والمثبت في درجتي 45 م ± أم المحاليل التالية المثبة في درجة 45 م :

أ) 6.3 ملل من محلول تيلوريت الغليسين (2.3.3)

ب) 1 ملل من محلول تيلوريت البوتاسيوم (3.3.3)

ج) 5 ملل من محلول مستحلب صفار البيض (4.3.3).

تخلط المحاليل أ. ب. ج جيدا في الوسط المذاب ويوزع مباشرة في علب بيتري بمقدار 15 ملل لكل علبة، يمكن حفظ العلب المحتواة على الوسط لمدة 48 ساعة في درجة أ م . مباشرة قبل الاستعمال، يوضع على سطح العلبة 0,5 ملل من محلول بيروفات البوتاسيوم ذي نسبة 20% (ك/ح) والمعقم بواسطة الترشيح، تجفف العلب الموضوعة أفقيا في درجة 50 م بحيث يكون سطح الهلام موجه إلى الأعلى. تلقح العلب عندما تجف.

يحفظ محلول البيروفات في درجتي 3-5 م ويجدد كل شهر .

4 . طريقة العمل 1.4 إذا تم صنع مسحوق الحليب في مدة تفوق 15 يوما قبل التحليل أو في تاريخ غير معروف، يضاف 1 ملل من الحليب معاد التكوين الموافق ل 0,1 غ من مسحوق الحليب في أنبوب يحتوي على مرق مغذي ل جيوليتي وكانتوني (4.1.3).

يمزج الإنوكيلوم جيدا مع الوسط مع تجنب تسرب الهواء.

تسكب بعد ذلك فوق الوسط سدادة من الهلام مذوبة بنسبة 2٪ (3.1.3) ثم تترك لتتجمد. 16 جمادى الأولى عام 1425 ه الجريدة الرسمية 4 يوليو سنة 2004 م 2.4 إذا تعلق الأمر بمساحيق تم صنعها في مدة تقل عن 15 يوما، يضاف 1 ملل من حليب معاد تكوينه في أنبوب يحتوي على مرق مالح يحتوي على لاكتوز وأحمر الفينول (كما يمكن استعمال وسط جيوليتي وكانتوني مثلما في 1.4). 3.4 يجفف الوسط و / أو أحد الأوساط المغذية المزروعة لمدة 24 ساعة في درجة 37 م (بمعنى 1.4 و/أو 2.4 ) 1.3.4 إعادة زرع حسب 6.4 و 7.4 أنابيب المرق المغذي لجيوليتي وكانتوني التي أخذت المظهر الأسود أو التي تحتوي على راسب أسود. 2.3.4 إعادة زرع حسب 7.4 ، أنابيب المرق المالح المحتوي على لاكتوز وأحمر الفينول التي تحول لونها إلى الأصفر. 4.4 تجفف الأنابيب الأخرى لمدة 24 ساعة إضافية ويعاد زرعها حسب 6.4 و 7.4. 5.4 طريقة إعادة زرع أنابيب المرق المغذي بعد تجفيفها مبينة في 6.4 و7.4. 6.4 تنزع سدادة الهلام في حالة الوسط جيوليتي وكانتوني حسب التقنية التالية :

تقطع سدادة الهلام بواسطة ملعقة وفق قطرين عمودين متقاطعين وإذا اقتضى الأمر، تمرر بعد ذلك الملعقة حول السدادة.

يوضع الأنبوب في زجاج بطريقة تسمح بسقوط قطع السدادة في قعر الأنبوب وفي نفس الوقت توضع البكتيريات على شكل محلول. 7.4 تقتطع حوالي 0,001 ملل من الزرع النامي في المرق المغذي بواسطة مقبض من البلاتين، ثم ينشر على سطح علبة تحتوي على وسط E.T.G.P.A بطريقة تسمح بالحصول على مستعمرات منفصلة. 8.4 نجفف العلب مقلوبة لمدة 24 ساعة في درجة م أ م .37 9.4 إخضاع ثلاث مستعمرات على الأقل نموذجية لاختبار الكواقولاس (12.4). تكون المستعمرات النموذجية ستافيلوكوكس أوروس سوداء، لامعة، ذات أطراف بيضاء رقيقة ومحاطة بمنطقة فاتحة منتشرة في الوسط الكثيف. 10.4 إذا لم تنم المستعمرات خلال 24 ساعة أو تم ملاحظة مستعمرات غير نموذجية فقط، في هذه الحالة تجفف العلب لمدة 24 ساعة إضافية في درجة 37م + أم. 11.4 في حالة نمو مستعمرات حسب (10.4)، تخضع ثلاث مستعمرات على الأقل لاختبار الكاطلاس.

لأجل هذا يؤخذ بواسطة مقبض بلاتيني، جزء من كل مستعمرة وتمزج في صفيحة محتوية على ماء أوكسجيني بنسبة %3,0 (10) أحجام. إذا لاحظنا تشكل فقعات غازية، تخضع المستعمرات الملائمة لاختبار الكواقولاس (حسب 12.4). 12.4 اختبار الكواقولاس 1.12.4 تلقح كل مستعمرة في أنبوب صغير يحتوي على 0.3 ملل من مرق قلب – مخ معقم. يجفف لمدة 20 إلى 24 ساعة في درجة 37 م ± أ م . 2.12.4 يضاف في أنبوب صغير 0.1 ملل من هذا الزرع إلى 0.3 ملل من بلازما الأرنب المضاف إليها 0,1 من E.D.TA 3.12.4 تجفف في درجة 37 م ± أم ثم تفحص الأنابيب لملاحظة تشكل تخثر كل ساعة لمدة 4 ساعات ثم بعد 24 ساعة.

5. نستنتج وجود ستافيلوكوك ذات الكواقولاس الإيجابي في عينة من مسحوق الحليب، إذا قامت ثلاث

(3) مستعمرات على الأقل متحصل عليها وفق 9.4 أو 11.4، بتخثير بلازما الأرنب.