Article 3

Le présent arrêté sera publié au Journal officiel de la République algérienne démocratique et populaire.

Fait à Alger, le 12 Joumada Ethania 1427 correspondant au 8 juillet 2006.

Lachemi DJAABOUBE.

LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 58 19 ANNEXE METHODE DE DETERMINATION DE LA TENEUR EN HISTAMINE DANS LES PRODUITS DE LA PECHE PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE

1. OBJET Cette méthode décrit le dosage de l’histamine dans le thon, la sardine, le maquereau, les anchois ou tout produit de la mer à l’état frais, congelé, fumé, séché, appertisé ou ayant subi tout autre traitement.

L’histamine est une amine provenant de la dégradation de l’histidine par décarboxylation. Sa présence, à des teneurs supérieures à 10 mg/100g dans des poissons, est susceptible de provoquer des phénomènes d’intoxication.

2. PRINCIPE L’histamine est solubilisée dans de l’acide trichloroacétique, complexée avec l’ortho-phtalaldéhyde, séparée par chromatographie liquide haute performance (CLHP) sur phases inverses, puis détectée par fluorométrie.

3. APPAREILLAGE

— broyeur ;

— balance ;

— pompe isocratique pour chromatographie liquide ,

— injecteur type RHEODYNE avec boucle d’injection de 20 μl ;

— colonne C18 (20 cm x 4 mm) : silice sphérique 5 μm greffée C18 avec éventuellement une pré-colonne ;

— détecteur fluorométrique à flux continu avec une cellule de 20 μl ;

— enregistreur intégrateur ;

— utilisation éventuelle d’un auto-préparateur - injecteur automatique.

4. REACTIFS

— solution d’acide trichloroacétique 20% (TCA 20%) ;

— dichlorhydrate d’histamine (184,07 mM) ;

— solution d’histamine à 3,33 mg/ml.

Dissoudre 165,6 mg de dichlorhydrate d’histamine dans 100 ml de TCA 10 %.

Diluer au 1/3 puis au 1/100 :

— solution d’orthophtalaldéhyde (OPA) à 10 mg/ml dans du méthanol ;

— solution de soude 2 N ;

— solution d’acide chlorhydrique 3 N ;

— acétonitrile pour CLHP ;

— solution 1 mM de di-potassium hydrogéno-phosphate (K2 HPO4 ).

Dissoudre 174,2 mg de K2HPO4 dans un litre d’eau ultra pure :

— solution éluante pour la chromatographie : 40 % d’acétonitrile et 60 % de solution 1 mM de K2 HPO4 ;

— filtre 5 μm ;

— papier filtre plissé n° 127.

5. MODE OPERATOIRE 5.1 Préparation du défécat trichloroacétique Broyer et homogénéiser un échantillon représentatif de 200 g environ et prélever immédiatement la prise d’essai. 5.1.1 Cas des poissons frais et congelés Homogénéiser 100 g d’échantillon avec 50 ml d’eau dans un broyeur puis ajouter 50 ml de solution TCA à 20 %, mélanger de nouveau et filtrer sur filtre en papier plissé n° 127. 5.1.2 Cas des poissons en conserve Même procédé avec 50 g de chair égouttée, 50 ml d’eau et 50 ml de solution TCA à 20 %. 5.1.3 Cas des semi-conserves Même procédé avec 40 g de chair, 100 ml d’eau et 50 ml de solution TCA à 20 %. 5.2 Réaction de complexation avec l’OPA Diluer au 1/10 dans de l’eau déminéralisée une fraction aliquote du filtrat et filtrer sur filtre de 5 μm.

La suite de la réaction peut se faire manuellement ou à l’aide d’un auto-préparateur-injecteur.

Prélever 100 μl de la solution au 1/10, ajouter 900 μl d’eau ultra-pure, alcaniser avec 200 μl de NaOH (2N) puis ajouter 100 μl de solution d’OPA (10 mg/ml), attendre quatre minutes puis bloquer la réaction en ajoutant 150 μl d’HCl (3N).

Bien agiter le tube après addition de chaque réactif et respecter rigoureusement les quatre minutes de temps de complexation. 5.3 Passage en chromatographie

— débit : 1 ml/min ;

— solvant d’élution : 40 % d’acétonitrile et 60 % de solution 1 mM de K2HPO4 ;

— volume injecté : 20 μl ;

— détection fluorométrique : longueur d’onde d’excitation 360 nm et longueur d’onde d’émission 450 nm ;

— enregistrement et intégration des aires des pics d’histamine ;

— le temps d’élution est d’environ 6 minutes.

Etalonnage externe (avec auto-préparateur)

— 100 μl d’une solution d’histamine à 3,33. 10-3 mg/ml ;

— 900 μl d’eau ; 20 septembre 2006

— 200 μl NaOH 2N ;

— 100 μl OPA 10 mg /ml, attendre 4 minutes;

— 150 μl HCl 3N, passage en CLHP.

Les 20 μl injectés renferment 4,6 mg d’histamine.

Si la teneur en histamine est faible, faire la réaction de complexation sur le défécat TCA non dilué, ou faiblement dilué, par contre, si celle-ci est élevée, diluer le défécat de sorte à obtenir une lecture chromatographique proche de la solution étalon.

Effectuer deux déterminations sur le même défécat préparé.

6. EXPRESSION DES RESULTATS 6.1 Calcul La teneur en histamine exprimée en mg pour 100 g d’échantillon est :

H = 6,66 x A poisson frais ou congelé —— As H = 10 x A poisson en conserve —— As H = 15,83 x A poisson semi-conserve —— As où :

As = aire du pic d’histamine de l’échantillon standard ;

A = aire du pic d’histamine de l’échantillon à analyser.

Prendre comme résultat la moyenne arithmétique des deux déterminations si les conditions de répétabilité sont remplies.

Exprimer le résultat à :

- 0,5 mg près (valeur absolue) pour des teneurs inférieures à 10 mg/100g ;

- 1 mg près (valeur absolue) pour des teneurs supérieures à 10 mg/100g ; 6.2 Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées par le même analyste ne doit pas excéder 5% en valeur relative. 6.3 Seuil de détection

- Poisson frais ou congelé : 0, 5 mg/100g ;

- Poisson en conserve: 0, 75 mg/100g ;

- Poisson semi-conserve:1 mg/100g.

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