المادة 3

ينشر هذا القرار في الجريدة الرسمية للجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية.

حرر بالجزائر في 26 رجب عام 1425 الموافق 11 سبتمبر سنة 2004.

نور الدين بوكروح الملحق منهج المراقبة الميكروبيولوجية للحليب المبستر

1- تحضير العينة للتجربة من الضروري جعل العينة متجانسة قبل كل تحليل، على سبيل المثال رج الرزم بعناية و بسرعة 25 مرة أو تطبق التقنيات المناسبة التي تعطي نتائج مطابقة.

فتح الرزم بصفة نظيفة، بعد تنظيف الفتحة بالإيتانول.

إجراء التحليل البكتيريولوجي في مدة لا تتعدى ثلاث دقائق.

تحفظ العينة في 6 °م إلى حين إجراء التحليل. 2 – التخفيفات العشرية تحضر التخفيفات العشرية بالمخفف التالي. 1.2 التركيب بيبتون البنكرياسي للكازيين (تريبتون) .......1 غ كلورور الصوديوم .... 8,5 ماء مقطر. . ،،،،،، 1000 ملل 2.2 التحضير تذوب المكونات في الماء بالتسخين الخفيف، وإذا اقتضى الأمر يعدل العامل الهيدروجيني pH، بحيث يكون بعد التعقيم 2017 في 25°م.

مثال على ذلك، يوزع بمقدار 100ملل في قارورات ذات سعة مناسبة.

تعقم بواسطة جهاز التعقيم في 121°م±1 لمدة 20 دقيقة 3.2. تحضير التخفيفات العشرية عند الاستعمال، يوزع المخفف بصفة نظيفة بمقدار 9 ملل في أنابيب معقمة ل 20 200x مم. لتحضير التخفيفات، يستعمل المخفف ذو درجة حرارة محيطية.

يتم الحصول على التخفيف عند 1/10 ينقل بصفة نظيفة 1ملل من الحليب إلى 9 ملل من المخفف (2.1) بواسطة ماصة معقمة تبلغ سعتها املل.

للحصول على التخفيف عند 1/100 ، ينقل 1 ملل من التخفيف عند 1/10 في أنبوب ثاني يحتوي على مخفف بواسطة ماصة جديدة معقمة تبلغ سعتها 1 ملل.

تحضر التخفيفات الموالية بنفس الطريقة.

أثناء تحضير التخفيفات و قبل زرعها، تخلط بعناية لمدة 5 إلى 10 ثوان بواسطة رجاج ميكانيكي ذي حركة دورانية خارج المركز.

3 - إحصاء الأعضاء المجهرية الهوائية في 30°م الهلام للإحصاء 1.3 التركيب بيبتون بنكرياسي للكازيين (تربيتون). 5,0 غ مستخلص الخميرة المجففة .................

غلوكوز منزوع الماء 1,0 مسحوق الحليب منزوع الزبدة (خال من المواد المثبطة) ............

أو حليب منزوع الزبدة (خال من المواد المثبطة). 10....... 10 أغار - أغار ..................... من 12 إلى 18غ ماء مقطر 1000 ملل 2.3 التحضير تذوب المكونات أو الوسط الكامل الجاف في الماء حتى الغليان وإذا اقتضى الأمر، يعدل العامل الهيدروجيني حيث يكون بعد التعقيم 2017 في 25°م .

يوزع بمقدار 100ملل في أنابيب ذات سعة مناسبة أو من 12 إلى 15 ملل في أنابيب ل 180x18 مم أو 20 x مم .200 يعقم بواسطة جهاز التعقيم في 121°م + 1 لمدة 20 دقيقة . يمكن حفظ الوسط ثلاثة أشهر على الأكثر في وسط مظلم في 0 م إلى 5 °م. 24 رمضان عام 1425 ه الجريدة الرسمية 7 نوفمبر سنة 2004 م 3.3 طريقة العمل ينقل مرتين 1 ملل من التخفيفات المتحصل عليها (3.2) في علب بيتري معقمة يبلغ قطرها 90 أو 100 مم.

يصب من 12 إلى 15 ملل من الوسط مذوب مسبقا ومبرد في حمام مائي في 45°م ± 0.5 ( يجب أن لا يتجاوز الحفظ في الحمام المائي 3 ساعات). يخلط الإينوكولوم في المركز بعناية.

يترك ليتجمد مع وضع العلب على سطح بارد و أفقي.

توضع علب بيتري مقلوبة في المجفف في 30°م 1 لمدة 72 ± 2 ساعة.

يجب أن لا تتجاوز المدة بين تحضير التخفيفات و إدخال الهلام في العلب 15 دقيقة. 4.3 التعبير عن النتائج يحتفظ بعلب بيتري المحتوية على عدد المستعمرات التي تتراوح بين 10 و 300 و ذلك من أجل إحصائها. تستعمل، إذا اقتضى الأمر ، عدسة ذات تكبير 1,5 على الأكثر. 5.3 طريقة الحساب يحسب عدد الأعضاء المجهرية لمليليتر واحد من الحليب عن طريق الصيغة التالية :

العدد الإجمالي للمستعمرات المحسوبة العدد / ملل : = الحجم المزروع للعينة Σ أو ( 1 + 0,1 2 ) ت بمعنى :

م : العدد الإجمالي للمستعمرات المحسوبة .

ع 1 : عدد العلب المحسوبة في التخفيف الأول ع 2 : عدد العلب المحسوبة في التخفيف الثاني.

ت : عامل التخفيف الذي انطلاقا منه تم الحصول على الحسابات الأولى.

مثال : التخفيف 10-2 278 و 290 مستعمرة التخفيف 10-3 33 و28 مستعمرة العدد / ملل : 278 + 290 + 33 + 28 629 = 28590 ) 2 + 0,1 2x ( 2-10 0,022 للتعبير عن عدد الأعضاء المجهرية، نكمل عدد صحيح إلى رقمين رمزيين.

إذا كان العدد المراد تكملته إلى عدد صحيح هو 5، يكتمل إلى عدد صحيح بطريقة تكون القيمة الموجودة في الجهة اليسرى زوجية.

في المثال المذكور، أعلاه، تقرب النتيجة إلى 29000 أو 2,9 x 410 إذا كانت العلب تحتوي على أقل من 10 مستعمرات، يعطى عدد الأعضاء المجهرية للمليليتر الواحد على شكل أقل من 10 ت حيث "ت" هو عكس عامل التخفيف الأكثر ضعفا.

إذا كانت العلب تحتوي على أكثر من 300 مستعمرة، نقوم بالتقدير انطلاقا من العلب التي تحتوي على عدد المستعمرات القريب من 300 مستعمرة . تعطى النتيجة بذكر العدد المقدر للأعضاء المجهرية للمليليتر الواحد).

يمكن التعبير عن النتيجة بعدد يتراوح بين 1 و 9,9 مضروب في 10 س حيث "س" هو القوة المناسبة 10 إذا أظهرت التجربة، بأن النتيجة المرتفعة لاختبارين مستقلين أجريا على نفس العينة، تتجاوز في أغلب الأحيان النتيجة الأدنى بنسبة 30% ، فإنه يتعين على المحلل توضيح طريقة عمله لتحديد مصدر الأخطاء.

4 - إحصاء الكوليفورم في 30°م والكوليفورم البرازي استعمال الهلام الذي يحتوي على لاكتوز وديزوكسيكولات الصوديوم بنسبة 0.5%. 1.4 التركيب بيبتون. ..................

لاكتوز.

ديزوكسيكولات الصوديوم. ...................

كلورور الصوديوم. 5 سترات الصوديوم.

أغار - أغار . من 12 إلى 15غ أحمر عادي.. 0,03 ماء مقطر.. 1000 ملل 26 الجريدة الرسمية للجمهورية 2.4 التحضير يتم التحضير فوريا. تحضر الكمية المناسبة مع عدم تعقيم في جهاز التعقيم.

تذوب المكونات أو الوسط الكامل الجاف في الماء و يترك يغلي.

يبرد الوسط بإبقائه في حمام مائي في 45°م 0.5 اجتناب الإفراط في تسخين الوسط : إن التسخين المطول أو المكرر ، يقلل من إنتقائيته ويضر بخاصية الاختبار. 3.4 طريقة العمل ينقل على مرتين 1 ملل من الحليب و 1 ملل من التخفيف عند 1/10(3.2) في علب بيتري معقمة يتراوح قطرها بين 90 أو 100 مم.

يصب 12 ملل من الهلام يحتوي على ديزو كسيكولات ثم يخلط الإينوكولوم مع الوسط. يترك ليتجمد بوضع العلب فوق سطح بارد وأفقي. عندما يتجمد الوسط، يصب حوالي 4 ملل من الوسط غير المزروع. يترك ليتجمد من جديد. 1.3.4 الكوليفورم في 30°م توضع علب بيتري مقلوبة في مجفف في 30°م 1 لمدة 24 + 2 ساعة. 2.3.4 الكوليفورم البرازي توضع علب بيتري مقلوبة في مجفف في 44°م ± 1 لمدة 24 + 2 ساعة. 4.4 التعبير عن النتائج 1.4.4 انتقاء العلب من أجل الحساب، يحتفظ بعلب بيتري التي تحتوي على أقل من 150 مستعمرة مميزة حمراء، داكنة يبلغ قطرها أقل من 0,5 مم. 2.4.4 طريقة الحساب تعطى نتيجة الكوليفورم للمليلتر الواحد من الحليب، بعد إجراء المعدل الجبري للمستعمرات المحسوبة على علب مزروعة لنفس حجم العينة.

كما يمكن الحصول على النتيجة انطلاقا من المعدل الجبري بين القيم المتحصل عليها عن طريق اختبار 1 ملل من الحليب و التخفيف العشري إلا في حالة ما إذا كانت نسبة القيمة الضعيفة أكبر من 2، فهنا، تؤخذ كنتيجة القيمة الأكثر ضعفا.

إذا كانت القيم متحصلا عليها انطلاقا من التخفيف العشري تضرب في عكس عامل التخفيف.

يمكن التعبير عن النتيجة بعدد يتراوح بين 1 و 9,9 مضروب في 10س حيث "س"هي القوة المناسبة ل 10.

5 - إحصاء ستافيلوكوكس استعمال هلام بيرد باركر . 1.5 التركيب بيبتون البنكرياسي للكازيين ( تربيتون)......10غ مستخلص ...الخميرة ... 1 غ مستخلص اللحم. 5 غ الغليسين. 12 كلورور الليتيوم. 5 أغار - أغار . من 12 إلى 20 غ ............. 1000 ملل تذوب المكونات في الماء ثم تسخن حتى الغليان، و إذا اقتضى الأمر ، يعدل العامل الهيدروجيني pH حيث يكون بعد التعقيم 10,172 في 25°م.

يوزع الوسط بمقدار 90 ملل في قارورات ذات سعة مناسبة.

يعقم بواسطة جهاز التعقيم في 121°م ±1 لمدة 15 دقيقة. يمكن حفظ الوسط لمدة شهر بين 0°م + 5 م . 2.5 الوسط الكامل و تحضير العلب عند الاستعمال و بعد ذوبان الوسط الأساسي (1,5)، يبرد الوسط في حمام مائي في 50م مع إضافة ل 90 ملل :

محلول مائي لتلوريت البوتاسيوم بنسبة 1 : 1 ملل محلول مائي لبيروفات الصوديوم بنسبة 20% : 5 ملل.

مستحلب صفار البيض، ذو تركيز يقدر بحوالي 20 % : 5 ملل.

الخلط بعناية عند كل إضافة ثم يصب الوسط بمقدار 28 ± 1 ملل في علب بيتري يبلغ قطرها 140 مم أو يصب 15 ملل أو 20 ملل في علب يبلغ قطرها 90 مم أو 100مم على التوالي.

يترك ليتجمد، ثم تجفف (incuber) العلب مقلوبة وبغطاء مفتوح في المجفف من 45 م و 53°م لمدة 30 دقيقة 24 رمضان عام 1425 ه الجريدة الرسمية 7 نوفمبر سنة 2004 م إجراء الزرع خلال 30 دقيقة الموالية لنهاية التجفيف ( incubation ) يمكن استعمال العلب المحتوية على هلام بيرد باركر غير الجاف خلال 24 ساعة في 0°م و + 5°م .

في حالة الشك عن وجود البروتوس، ننصح بإضافة محلول سولفاميزاتين.

سولفاميزاتين. 02 محلول هيدروكسيد الصوديوم 0,1 مول/ل .......... ملل ماء (الكمية الكافية ل). 100 ملل يذوب سولفاميزاتين في محلول هيدروكسيد الصوديوم، يكمل إلى 100 ملل بإضافة الماء.

يعقم المحلول عن طريق الترشيح على غشاء.

عند الاستعمال، وبعد ذوبان الهلام، يضاف 27,5 ملل من هذا المحلول إلى 100ملل من الوسط الأساسي. 3.5 طريقة العمل 1.3.5 الزرع يتم زرع املل من الحليب حسب شكل علب بيتري بالطريقة التالية :

علب ذات 140مم : ينشر على سطح الوسط الحجم الإجمالي بواسطة ناشر زجاجي معقم.

علب ذات 90 مم أو 100 مم : توزيع 1 ملل على سطح الوسط لثلاث علب بيتري على شكل ثلاثة أقسام متساوية تقريبا ثم تنشر بواسطة نفس الناشر للعلب الثلاثة.

بعد 15 دقيقة، توضع علب بيتري مقلوبة في المجفف في 37 °م ± 1 لمدة 24 إلى 48 ساعة. 2.3.5 انتقاء العلب و اختيار المستعمرات بعد التجفيف ( incubation) لمدة 24 و 48 ساعة، نؤشر في قعر العلب على المستعمرات المميزة و/أو غير المميزة.

المستعمرات المميزة: مستعمرات سوداء، لامعة، محدبة محاطة بمنطقة شبه شفافة. يمكن أن يظهر في هذه المنطقة الشفافة بعد 24 ساعة، حلقة متلألئة متصلة مباشرة مع المستعمرات.

المستعمرات غير المميزة مستعمرات سوداء لامعة، محدبة أو رمادية سوداء لديها في بعض الأحيان مظهر جامد و نسيجها جاف لا تحتوي على منطقة شفافة ( ماعدا بعض المستعمرات الرمادية السوداء).

و يحتفظ من أجل الحساب، بالعلب المحتوية على أقل من 250 مستعمرة مميزة أو غير المميزة لكل علبة 140 مم وبالعلب المحتوية على 150 مستعمرة مميزة و/ أو غير مميزة لكل علبة 90 مم أو 100 مم .

من أجل اختبار الكواقولاس،تقتطع خمس مستعمرات مميزة و/ أو غير مميزة كحد أقصى، يؤخذ بعين الاعتبار العدد الخاص لكل منها.

بنفس الطريقة، تقتطع عشر مستعمرات كحد أقصى بالنسبة لحجم موزع على ثلاث أقسام أو مضعف العدد . 3.3.5 اختبار الكواقولاس تزرع المستعمرة في مرق القلب و تجفف في المجفف في 37°م لمدة 20 إلى 24 ساعة .

من أجل اختبار الكواقولاس، يستعمل بلازما الأرنب المحتوية على EDTA (حمض الأتيلين ثنائي أمين تيترا أستيك ( في حالة عدم وجود هذه الأخيرة، يضاف محلول EDTA بشكل تكون نسبة التركيز النهائي في بلازما أعيد تمييهها 0,1 %.

يعتبر الاختبار إيجابي، عندما يغطي الكواقولوم اكثر من ثلاث أرباع الحجم الأولي . 4.5 التعبير عن النتائج إذا كانت على الأقل 80% من المستعمرات المختبرة ذات كواقولاس إيجابي، فتعتبر كل المستعمرات المحسوبة موافقة ل ستافيلوكوكوس اوروس أو يعبر عن النتيجة الإجمالية بأخذ بعين الاعتبار النسب (مستعمرات مميزة و مستعمرات غير المميزة). يمكن التعبير عن النتيجة بعدد يتراوح بين 9,9 مضروب في 10 س حيت "س" هو القوة المناسبة .10

6 - البحث عن السالمونيلا 1.6 استعمال الأوساط الكاملة المنزوع منها الماء و الموافقة للبيانات المذكورة أدناه. 2.6 طريقة العمل 1.2.6 الاغتناء الأولي لتسهيل طريقة العمل، تقتطع بصفة نظيفة 250 ملل من الحليب لكل وحدة من الوحدات الخمس وتجمع في وعاء معقم تقدر سعته من 5,1 إلى 2 لتر.

يترك في درجة حرارة محيطية لمدة ساعة واحدة، يعدل العامل الهيدروجيني إذا اقتضى الأمر، إلى حوالي 6,8. ندخل بصفة نظيفة 2,25 ملل من محلول مائي إلى 1% من الأخضر اللامع. يخلط بعناية. 28 الجريدة الرسمية للجمهورية يجفف بالمجفف في 37°م لمدة 20 ± 2 ساعة. 2.2.6 الاغتناء النهائي إدخال 10 ملل من الحليب المغذي مسبقا في 100 ملل من مرق مولير - كوفمان يحتوي على تيتراتيونات والأخضر اللامع، يجفف في حمام مائي في 43° م ± 1 لمدة 48 ساعة و في 100 ملل من مرق سيلينات – سيستين، يجفف في المجفف في 37°م ± 1 لمدة 48 ساعة. 3.2.6 العزل بعد التجفيف ( incubation)، يجرى العزل انطلاقا من كل مرق . إجراء العزل على سطح وسطين مختارين صلبين يصبان من الأفضل في علب بيتري ذات 140مم.

استعمال الهلام المحتوي على الأخضر اللامع وأحمر الفينول والهلام المحتوي على سولفات بيسميث بسبب احتمال وجود سالمونيلا غير النموذجي ولاكتوز الموجب، نستطيع استبدال الهلام المحتوى على الأخضر اللامع وأحمر الفينول بوسط أخر مختار مثال على ذلك، هلام XLD، هلام هيكتوان.

إعادة العلب إلى المجفف في 37°م لمدة 18 إلى 20 ساعة . إذا كانت مدة التجفيف غير كافية لنمو المستعمرات، نواصل التجفيف (incubation).

إخضاع عدد كاف من المستعمرات المميزة أو المشكوك فيها لاختبارات بيوكيميائية الكلاسيكية.