المادة 3

ينشر هذا القرار في الجريدة الرّسمية للجمهوريّة الجزائريّة الدّيمقراطيّة الشّعبيّة.

حرر يالجزائر في 14 مح رم ع ام 1439 الم وافق 5 أكتوبر سنة .2017 محمد بن مرادي الملحق منهج أفقي لإحصاء بكتيريا القولون عن طريق حساب المستعمرات.

1 . مجال التطبيق :

يحدد هذا المنهج توجيهات عامة لإحصاء بكتيريا القولون.

يطبق هذا المنهج على المواد الموجهة للاستهلاك البشري والتغذية الحيوانية، وعينات من البيئة بجوار إنتاج ومعالجة المواد الغذائية، وهذا عن طريق حساب المستعمرات بعدالتحضين في 03°م أو في 73°م في وسط صلب.

ملاحظة :

في حالة مادة الحليب ومشتقاته، تكون درجة حرارة التحضين °30 م.

يوصى بهذا المنهج عندما يكون من المفترض أن العدد المنتظر أكبر من 100 بكتيريا القلون في الميليلتر أو في الغرام من العينة ا لمختبرة.

2 . تعريف :

بكتيريا القولون :

هي بكتيريا تشكل مستعمرات مميزة في درجة حرارة معينة، في هلام لاكتوزي صفراوي بالكريستال البنفسجي والأحمر المعتدل والتي تخمر اللاكتوز أثناء تجارب الإثبات مع انطلاق غاز وهذا عندما يجري التحليل في الشروط المحددة في هذا المنهج.

3 . المبدأ : .3 1 تحضير علبتي بيتري، باستعمال وسط زرع انتقائي صلب وكمية محددة من عينة التجربة، إذا كان المنتوج الأولي سائلا أو كمية محددة من المحلول الأم في حالة المواد الأخرى. 72 24 ربيع الأول عام 1439 ه ديسمبر سنة م تحضير علب بيتري أخرى في نفس الشروط، باستعمال تخفيفات عشرية لعيّنة التجربة أو للمحلول الأم.

3 . 2 تحضن الع لب في 03°م أو في 37 °م لمدة 24 سا.

3 . 3 حساب المستعمرات المميزة، وإذا اقتضى الأمر، إثبات عدد المستعمرات عن طريق تخمر اللاكتوز.

3 . 4 حساب عدد بكتيريا القولون في الميليلتر أو في الغرام من العينة انطلاقا من عدد المستعمرات المميزة المحصاة في كل علبة بيتري.

4 . أوساط الزرع والمخففات :

4 . 1 عموميات :

تستعمل أثناء التحليل، فقط كواشف ذات نوعية تحليلية معترف بها وماء مقطر أو ماء منزوع الأيونات معقم.

4 . 2 المخففات :

من الأحسن تحضير المخففات طبق ا للتوصيات المحددة في المناه ج المتعلق ة بتحضي ر عي نات التجربة والمحلول الأم والتخفيفات العشرية قصد الفحص الميكروبيولوجي، المحددة في التنظيم المعمول به. 3.4 وسط الزرع :

4 . 3 1. وسط انتقائي صلب : هلام لاكتوزي صفراوي بالكريستال البنفسجي والأحمر المعتدل )VRBL( :

4 . 3 1. 1. التركيب :

عصارة أنزيمية لأنسجة الحيوانات 7 غ مستخلص الخميرة 3 غ لاكتوز ( O ,H2 O11 H22 12 )C 10 غ كلورور الصوديوم 5 غ الأملاح الصفراوية 1,5 غ أحمر معتدل 0,03 غ كريستال بنفسجي 0,002 غ أغار - أغار 12 إلى 18 غ أ) ماء 1000 ملل

أ) حسب قدرة تصلب أغار - أغار 24 ربيع الأول عام 1439 ه 13 2017 الجريدة الرّسميّة ديسمبر سنة م .4 .3 .1 2 التحضير :

للحفاظ على القدرة الانتقائية للوسط وخاصيته، من الأحسن القيام بما يأتي :

تمزج المكونات أو الوسط الكامل المجفف بعناية مع الماء ويترك ليرتاح عدة دقائق. يضبط العامل الهيدروجيني ( )PH بحيث يصبح بعد الغليان 7,4 ± 0,2 في 25 °م.

يسخن حتى الغليان مع الرج من وقت لآخر.

يترك يغلي لدقيقتين ويوضع الوسط ليبرد مباشرة في الحمام المائي ( )5.5 في درجة حرارة 44 °م إلى 74°م.

يتجنب التسخين المفرط للوسط (تسخين مطول أو تسخينات مكررة).

لا يعقم الوسط في جهاز التعقيم.

تراقب نقاوة الوسط وقت الاستعمال .)2.2.8( يستعمل الوسط في الأربع (4) ساعات التي تلي تحضيره. .4 .3 2 وسط الإثبات : مرق لاكتوزي صفراوي بالأخضر اللاّمع : .4 .3 .2 1 التركيب :

عصارة أنزيمية للكازيين 10 غ لاكتوز ( O ,H2 O11 H22 12 )C 10 غ صفراء الثور مجففة 20 غ الأخضر اللامع 0,0133 غ ماء 1000 ملل .4 .3 2.2 التحضير :

تذوّب مكونات الوسط الكامل المجفف في الماء مع التسخين ببطء، إذا اقتضى الأمر، في حمام مائي .)5.5( يضبط العامل الهيدروجيني )PH( إذا اقتضى الأمر، بحيث يصبح بعد التعقيم، 7,2 ± 0,2 في °25 م توزع الأوساط بكميات تساوي 10 ملل في أنابيب اختبار )7.5( تحتوي على أجراس دورهام )Durham( .)8.5( تعقّم في جهاز التعقيم )1.5( في °121 م لمدة 15 دقيقة.

يجب ألاّ تحتوي أجراس دورهام على فقاعات الهواء بعد التعقيم. .5 التجهيزات والأدوات الزجاجية :

الأجهزة المتداولة في مخبر الميك روب يول وجيا، لا سيما ما يأتي : .5 1 جهاز للتعقيم بالحرارة الجافة ( فرن ) أو بالحرارة الرطبة (جهاز التعقيم). .5 2 جهاز تحضين مضبوط في 03°م ± 1°م أو 73°م ± 1°م. .5 3 علب بيتري من الزجاج أو من البلاستيك قطرها 90 ملم إلى 100 ملم. 4.5 ماصات ذات تدفق إجمالي سعتها 1 ملل. 5.5 حمام مائي أو جهاز مماثل له قدرة التشغيل من 44°م إلى °47 م أو في °100 م. 6.5 جهاز لحساب المستعمرات مزود بجهاز الإضاءة وعداد رقمي، ميكانيكي أو إلكتروني. 7.5 أنابيب اختبار أبعاده ا بالت قريب 16 م لم × 160 ملم. 8.5 أجراس دورهام ذات أبعاد ملائمة قصد استخدامها داخل أنابيب الاختبار .)7.5( 9.5 قارورات للتسخين وحفظ أوساط الزرع. .5 10 جهاز قياس العامل الهيدروجيني )PH( بدقة 0,1 وحدة )PH( في °25 م. 11.5 مقبض حلقي من البلاتين إيريديوم أو من النيكل كروم قطره 3 ملم بالتقريب أو مقابض ذات الاستعمال الوحيد. .6 اقتطاع العينات :

يجب أن تكون العينة ممثلة حقا غير متلفة أو تغيرت أثناء النقل والتخزين.

يجب أن يجري اقتطاع العينات طبقا للشروط المحددة في التنظيم المعمول به، أو إذا لزم الأمر للمواصفات المعترف بها. .7 تحضيرات عينة التجربة :

يجب أن تحضر عينة التجربة طبقا لمناهج التحاليل المحددة في التنظيم المعمول به.

8 . طريقة العمل : 8 1. العينة المأخوذة للتجربة والمحلول الأم والتخفيفات :

يجب أن يحضر المحلول الأم والتخفيفات طبقا للمناهج المتعلقة بتحضير عينات التجربة، المحلول الأم والتخفيفات العشرية قصد الفحص الميكروبيولوجي المحددة عن طريق التنظيم الساري المفعول. 2.8 الزرع والتحضين : .8 .2 1 تؤخذ علبتا بيتري معقمتين للمنتوج السائل و/أو لكل تخفيف مختار. وتنقل بواسطة ماصة معقمة (5.4)، 1 ملل من السائل أو تخفيفات ملائمة في مركز كل علبة. وتستعمل ماصة جديدة معقمة لزرع كل تخفيف داخل العلب. 24 الجريدة الرّسميّة للجمهوريّة .8 .2 2 يسكب حوالي 15 ملل من وسط VRBL )1.3.4( في درجة حرارة °44 م إلى °47 م، في كل علبة بيتري. يجب ألاّ يتعدى الوقت 15 دقيقة بين نهاية تحضير المحلول الأم ( أو التخفيف 10-1 في حالة منتوج سائل ) والوقت الذي يسكب فيه الوسط في العلب.

يمزج الإنوكيلوم )inoculum( بعناية في وسط الزرع ويترك المزيج يتصلب بوضع علب بيتري فوق سطح بارد وأفقي.

تحضر كذلك علبة بيتري كشاهد تحتوي على حوالي 15 ملل من الوسط وذلك لمراقبة نقاوته. .8 .2 3 بعد التصلب الكامل، يسكب فوق السطح المزروع حوالي 4 ملل من وسط VRBL (4.3.1)، في درجة حرارة من °44 م إلى درجة 74°م. يترك ليتصلب كما هو مبين أعلاه. .8 .2 4 تقلب العلب المحضرة بهذه الطريقة وتحضن في جهاز التحضين )2.5( مضبوط في °30 م أو في °37 م لمدة 24 سا ± 2 سا. 3.8 الإحصاء :

بعد فترة التحضين المحددة في النقطة (8.2.4)، تختار علب بيتري التي تحتوي على عدد محصور بين 10 و 150 مستعمرة إذا أمكن. بواسطة العداد )6.5( يجرى حساب المستعمرات البنفسجية التي لها قطر أدنى يساوي 0,5 ملم (في بعض الأحيان محاطة بمنطقة حمراء ناتجة عن ترسب الصفراء). تعتبر هذه المستعمرات كمستعمرات نموذجية لبكتيريا القولون ولا تحتاج إلى إثبات.

تحصى كذلك وتثبت المستعمرات غير النموذجية (على سبيل المثال المستعمرات أقل حجما) وكل المستعمرات الناتجة عن مشتقات الحليب التي تحتوي على سكريات مغايرة عن اللاكتوز مباشرة بعد مدة التحضين حسب .)4.8( يمكن أن يؤدي تحول السكريات، ماعدا اللاكتوز، إلى تشكل مستعمرات لها شكل مشابه للمستعمرات النموذجية لبكتيريا القولون.

ملاحظة :

يتعلق مظهرالمنطقة الحمراء الناتجة عن ترسب الصفراء والتي تحيط بالمستعمرات، بنوع بكتيريا القولون وبنوعية الوسط. .8 4 الإثبات :

تزرع، إذا اقتضى الأمر، خمس (5) مستعمرات غير نموذجية في أنابيب تحتوي على مرق لاكتوزي بالصفراء والأخضر اللامع .)2.3.4( توضع الأنابيب في جهاز التحضين )2.5( مضبوط في °30 م أو في °37 م لمدة 24 سا ± 2 سا. 72 24 ربيع الأول عام 1439 ه ديسمبر سنة م تعتبر المستعمرات التي تظهر انطلاق غاز في أجراس دورهام )Durham( )8.5( كبكتيريا القولون.

تؤخذ بعين الاعتبار هذه النتائج في الحساب .(9) .9 التعبير عن النتائج : .9 1 طريقة الحساب، حالة بعد التعريف أو الإثبات:

عندما يشترط المنهج المستعمل إثباتا، يجري انطلاقا من كل علبة مأخوذة بعين الاعتبار لإحصاء المستعمرات إثبات العدد المحدد A (عامة يكون 5) من المستعمرات المميزة المفترضة.بعد الإثبات، يحسب العدد a للمستعمرات التي تستجيب لمعايير الإثبات في كل علبة بواسطة المعادلة الآتية : b C x = a A حيث : b : هو عدد المستعمرات التي تستجيب إلى معايير الإثبات من بين المستعمرات A المعرّفة، C : هو العدد الإجمالي للمستعمرات المميزة المفترضة المحسوبة فوق العلبة.

تقرب النتائج المحسوبة إلى عدد طبيعي الأقرب، لذلك إذا كان العدد الأول بعد الفاصلة أقل من 5، لا يغير الرقم الذي يسبق، وإذا كان الرقم الأول الذي بعد الفاصلة أكبر أو يساوي 5، يرفع الرقم الذي يسبق بوحدة.

يحسب العدد N للأجسام الدقيقة التي تم تعريفها أو إثباتها والموجودة في عينة التجربة، بواسطة المعادلة الآتية : α ∑ = N d × 1,1 V× حيث : α ∑ : هو مجموع المستعمرات التي تستجيب لمعايير الإثبات والمحصاة في العلبتين المأخوذتين بعين الاعتبار لتخفيفين متتاليين، V : هو حجم اللقاح )inoculum( الموضوع في كل علبة، بالميليلتر، d : هو قيمة التخفيف الموافق للتخفيف الأول المأخوذ بعين الاعتبار.

تقرب النتيجة إلى رقمين ممثلين لذلك إذا كان الرقم الثالث أقل من 5، لا يغير الرقم الذي يسبق، وإذا كان الرقم الثالث أكبر أو يساوي 5، يرفع الرقم الذي يسبق بوحدة. 24 ربيع الأول عام 1439 ه 13 2017 الجريدة الرّسميّة ديسمبر سنة م يعبر عن النتيجة، من الأحسن كعدد محصور بين 1 و 9,9 مضروب في القوة المناسبة ل 10، أو في عدد طبيعي متكون من رقمين ممثلين.

يعبر عن النتيجة بالعدد N لبكتيريا القولون في الميليلتر (منتوجات سائلة) أو بالغرام (منتوجات أخرى).

مثال : أعطى الحساب النتائج الآتية :

- في التخفيف الأول المأخ وذ بع ين الاعت بار ( 10 - )3 : 66 مستعمرة،

- في التخفيف الثاني المأخوذ بعين الاعتبار 10( - )4 : 4 مستعمرات.

أخضعت المستعمرات المنتقاة إلى تجارب التعريف أو الإثبات :

- من بين 66 مستعمرة، 8 مستعمرات أخضعت إلى التجارب، حيث استجابت 6 منها إلى معايير الإثبات، حيث a = 50،

- من بين 4 مستعمرات، كلها استجابت إلى معايير الإثبات، حيث a = .4 54 50+4 α ∑ 16545 = = = = N 3-1,1×10 3-1×1,1×10 d × 1,1 V× بتقريب النتيجة كما هو محدد أعلاه، يصبح عدد بكتيريا القولون 17000 أو 1,7 × 410 في الميليلتر أو في الغرام من المنتوج. ★